Os vírus e seus derivados têm muitas aplicações em biomedicina, bio e nanotecnologia. Em terapia genética, os vírus são usados como vetores para fornecer genes modificados nas células-alvo, para tratar ou prevenir uma doença: 

  • Substituir um gene mutado que cause doença por uma cópia saudável do gene
  • Inativar ou "derrubar" um gene mutado que esteja funcionando indevidamente
  • Introduzir um novo gene no corpo para ajudar a combater uma doença ou tratar uma síndrome


Adenovírus, retrovírus, lentivírus, vírus adeno-associados (AAV) e outros vírus animais têm sido utilizados no desenvolvimento de terapias genéticas ao longo de várias décadas. Nos últimos anos, essa área de aplicação tem observado um crescimento significativo, em grande parte por causa dos desenvolvimentos na engenharia vetorial AAV recombinante e na produção de terapias genética in vivo.

A fim de desenvolver vetores eficazes de terapia genética produzidos por meio de processos de fabricação controlados e econômicos, vários desafios devem ser superados.  Eles vão desde o design capsídeo até à identificação de condições ideais de processo e formulação, chegando ao controle de qualidade abrangente das substâncias medicamentosas e dos produtos medicamentosos. 

Aplicação das soluções da Malvern Panalytical pelo fluxo de trabalho do desenvolvimento de terapia genética in vivo

Desde o design de capsídeo, passando pela otimização das condições de processo posteriores, até testes de formulação e estabilidade e a caracterização estendida de substâncias medicamentosas e produtos medicamentosos, tecnologias como Dispersão de luz dinâmica (DLS), Dispersão de luz eletroforética (ELS)Dispersão de luz dinâmica multiângulo (MADLS), Dispersão de luz multiângulo de cromatografia (SEC-MALS), Análise de rastreamento de nanopartículas (NTA), Calorimetria de titulação isotérmica (ITC) e Calorimetria de varredura diferencial (DSC) são usados para informar os cientistas sobre atributos analíticos e de qualidade-chave de vetores virais, possibilitando a caracterização, a comparação e a otimização de:

  • Tamanho de capsídeo (DLS, SEC, NTA)
  • Titulação de capsídeo ou contagem de partículas (MADLS, SEC, NTA)
  • Porcentagem de partículas de vírus que contêm genoma/% de análise completa (SEC
  • Formação agregada (DLS, MADLS, SEC, NTA)
  • Fragmentação (SEC)
  • Estabilidade térmica (DLS, DSC)
  • Análise da estrutura de ordem superior (DSC)
  • Identificação do sorotipo (DSC)
  • Revelação de capsídeo e ejeção do genoma (DLS e DSC)
  • Ligação ao receptor (ITC)
  • Carga (ELS)


DLS, MADLS, SEC-MALS, NTA, ITC e DSC são técnicas biofísicas sem rótulo que requerem desenvolvimento mínimo de ensaio e podem ser prontamente aplicadas em todos os estágios, fortalecendo o fluxo de trabalho analítico para o desenvolvimento da terapia genética.

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Pesquisa e desenvolvimento inicial: projeto de capsídeo viral

Embora o processo de descoberta da terapia genética seja mais curto do que o normalmente visto na descoberta tradicional de medicamentos, o alto grau de complexidade do produto introduz desafios adicionais que devem ser abordados logo no início para garantir a entrega de produtos seguros e eficazes. Entre esses desafios estão:

  • Seleção de um capsídeo viral com base nas propriedades ideais e na função
  • Engenharia racional de proteínas para melhorar e modificar as propriedades e as funcionalidades do capsídeo viral original


As soluções em ambos os casos se baseiam em um conjunto abrangente de dados físico-químicos, bioquímicos e biológicos que informa sobre o desempenho do vetor viral e reatualiza o processo de seleção. 

Neste estágio, a extensa caracterização biofísica de capsídeos projetados e vetores virais usando DLS, MADLS, SEC-MALS, ITC e DSC dá suporte à avaliação confiável de métricas de qualidade importantes e interpretação dos resultados de ensaios bioquímicos e biológicos por meio de medições de tamanho e titulação de capsídeo, formação de agregados, % de medição total, ligação de receptores, estabilidade térmica e propensão à revelação de capsídeo.

Soluções em destaque

Desenvolvimento do processo de terapia genética

O processo de produção de terapia genética deve atender a requisitos regulatórios rigorosos e a outras expectativas internas em termos de qualidade, prazos e custos. São necessárias soluções adequadas para apoiar e fortalecer o fluxo de trabalho analítico e responder a desafios referentes a: 

  • Alto grau de complexidade do produto
  • Diversidade de vetores virais para distribuição genética no design e no desenvolvimento 
  • Processamento abaixo do ideal com longos ensaios analíticos que sofrem de uma variabilidade significativa


Durante todo o processo de purificação posterior, vários ensaios são realizados para determinar os principais atributos analíticos que determinam o rendimento e relatam atributos críticos de qualidade (CQAs), como pureza de vetor viral, potência, estabilidade e segurança.  Esses parâmetros normalmente são, embora não se limitem a, os seguintes:  

  • Titulação de capsídeo ou contagem de partículas
  • Contagem de genomas
  • Porcentagem de partículas de vírus que contêm genoma ou % de análise completa
  • Caracterização do sorotipo
  • Formação agregada 
  • Contaminação por proteínas e nucleotídeos indesejados em células hospedeiras 


Os três primeiros parâmetros (titulação de capsídeo, contagem de genoma, % de análise completa) normalmente são medidos utilizando dois ou mais dos seguintes ensaios: qPCR, ddPCR, ELISA, AUC, HPLC-AEX e/ou TEM.  Cada método tem pontos fortes e fracos intrínsecos relacionados a requisitos de parâmetro medido, produtividade, velocidade, exatidão e volume de amostra. 

Terapia genética: caracterizar, comparar, otimizar

No desenvolvimento de processos para vetores virais, como AAVs, o Zetasizer Ultra é indicado como um ensaio complementar que pode ser utilizado em fluxos de trabalho analíticos existentes e fornece uma medição rápida, sem rótulo, não destrutiva, de baixo volume e ortogonal da concentração total de partículas de vírus, titulação de capsídeo, tamanho de capsídeo, carga, formação de agregados, estabilidade térmica e descoberta de capsídeo.

A análise exata e precisa do tamanho é essencial para a medição da concentração de partículas. O Zetasizer Ultra utiliza três ângulos de dispersão para fornecer uma medição mais precisa e de maior resolução. Em MADLS, as informações da dispersão dos ângulos traseiro, lateral e frontal são coletadas e combinadas em uma única distribuição do tamanho de resolução mais alta que fornece dados mais representativos.

Cromatografia por exclusão de tamanho (SEC) tem sido usada há muito tempo como uma ferramenta fundamental para medir o peso molecular de macromoléculas, proteínas, vírus, polissacarídeos e polímeros. OMNISEC, um sistema SEC de detecção múltipla, pode fornecer dados sobre vários atributos analíticos e de qualidade importantes de AAVs, como titulação de capsídeo e genoma, além da % total – tais dados não são acessíveis somente por meio da detecção de UV. Esses parâmetros importantes fornecem informações vitais sobre pureza, potência e estabilidade do vetor viral.

Calorimetria de varredura diferencial (DSC) é uma ferramenta bem estabelecida na caracterização e no desenvolvimento de produtos baseados em vírus, inclusive diversas vacinas comerciais. Além de várias métricas de estabilidade para vetores virais, a DSC oferece uma TM de desintegração de capsídeo característica de uma ID de sorotipo, mapeia a estabilidade térmica, marca impressões digitais de uma estrutura superior e pode detectar alterações estruturais em resposta a alterações de tensão, formulação ou condição do processo.

A estabilidade e a função de capsídeo viral encontram um bom equilíbrio permanente. Os capsídeos virais devem ser estáveis o suficiente para conter e proteger o genoma, ligar-se à superfície da célula hospedeira para absorção celular e navegar pelo meio celular. No entanto, um capsídeo viral também deve oferecer capacidade de conformidade suficiente para liberar o genoma no local de replicação.

O mecanismo de revelação do vetor AAV continua mal compreendido, mas a mudança estrutural parece ser necessária para revelação de capsídeo e liberação de genoma.  A propensão do vector viral à revelação é postulada para se correlacionar com um atributo de qualidade importante: infectividade. A DSC, com ganhos térmicos na dispersão da luz dinâmica, pode ser utilizada para avaliar a propensão de revelação de um capsídeo viral em resposta a condições de tampão e de estresse.

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