Viren und ihre Derivate finden häufig Anwendung in der Biomedizin sowie in der Bio- und Nanotechnologie. Bei der Gentherapie werden Viren als Vektoren verwendet, um modifizierte Gene in die Zielzellen einzuschleusen, um eine Erkrankung zu behandeln oder zu verhindern, indem: 

  • ein mutiertes Gen, das zu einer Erkrankung führt, durch eine gesunde Kopie des Gens ersetzt wird
  • ein mutiertes Gen, das nicht richtig funktioniert, inaktiviert oder „kaltgestellt“ wird
  • ein neues Gen zur Behandlung einer Erkrankung oder eines Syndroms in den Körper eingeschleust wird


Adenoviren, Retroviren, Lentiviren, Adeno-assoziierte Viren (AAVs) und andere tierische Viren werden seit mehreren Jahrzehnten in der Entwicklung von Gentherapien eingesetzt. In den letzten Jahren hat dieser Anwendungsbereich ein signifikantes Wachstum verzeichnet, vor allem durch die Fortschritte bei der Entwicklung und Produktion von rekombinanten AAV-Vektoren für In-vivo-Gentherapien.

Um wirksame Vektoren für die Gentherapie zu entwickeln, die in kontrollierten und wirtschaftlichen Fertigungsprozessen produziert werden, müssen zahlreiche Herausforderungen gemeistert werden.  Diese reichen von der Kapsid-Gestaltung über die Ausarbeitung der optimalen Prozess- und Formulierungsbedingungen bis hin zur umfassenden Qualitätskontrolle von Wirkstoffen und Arzneimitteln. 

Anwendung von Malvern Panalytical Lösungen bei der Entwicklung von In-vivo-Gentherapien

Von der Kapsid-Gestaltung über die Optimierung nachgelagerter Prozessbedingungen bis hin zur Formulierung und zu Stabilitätstests und der erweiterten Charakterisierung von Wirkstoffsubstanzen und Arzneimitteln werden Technologien wie die dynamische Lichtstreuung (DLS), elektrophoretische Lichtstreuung (ELS), dynamische Mehrwinkellichtstreuung (MADLS), Größenausschluss-Chromatographie mit Mehrwinkellichtstreuung (SEC-MALS), Nanoparticle Tracking Analysis (NTA), isotherme Titrationskalorimetrie (ITC) und dynamische Differenzkalorimetrie (DSC) eingesetzt, um Wissenschaftlern Informationen zu wichtigen Analyse- und Qualitätsmerkmalen der Virenvektoren bereitzustellen und damit folgende Parameter charakterisieren, vergleichen und optimieren zu können:

  • Kapsid-Größe (DLS, SEC, NTA)
  • Kapsid-Titer oder Partikelanzahl (MADLS, SEC, NTA)
  • Prozentsatz der Virenpartikel mit Genomen/vollständige Prozentanalyse (SEC
  • Aggregatbildung (DLS, MADLS, SEC, NTA)
  • Fragmentierung (SEC)
  • Thermische Stabilität (DLS, DSC)
  • Hochgeordnete Strukturanalyse (DSC)
  • Serotyp-Identifizierung (DSC)
  • Kapsid-Uncoating und Genomfreisetzung (DLS und DSC)
  • Bindung an Rezeptor (ITC)
  • Ladung (ELS)


DLS, MADLS, SEC-MALS, NTA, ITC und DSC sind markerfreie biophysikalische Techniken, die eine minimale Assay-Entwicklung erfordern und in allen Phasen problemlos angewendet werden können, was den analytischen Workflow der Gentherapieentwicklung unterstützt.

Vorgestellte Lösungen

Vorgestellte Technologien

Forschung und frühe Entwicklung: Gestaltung von Viruskapsiden

Obwohl der Entdeckungsprozess bei der Gentherapie kürzer ist als bei der herkömmlichen Arzneimittelforschung üblich, stellt die hohe Produktkomplexität zusätzliche Herausforderungen dar, die frühzeitig gemeistert werden müssen, um sichere und effiziente Produkte zu gewährleisten. Zu diesen Herausforderungen gehören:

  • Auswahl eines Viruskapsids anhand optimaler Eigenschaften und Funktion
  • Rationales Protein-Engineering zur Verbesserung und Änderung der Eigenschaften und Funktionen des ursprünglichen Viruskapsids


Die Lösungen basieren in beiden Fällen auf umfassenden physikalisch-chemischen, biochemischen und biologischen Daten, die die Leistung des Virusvektors bestimmen und Informationen für den Auswahlprozess liefern. 

In dieser Phase unterstützt die umfassende biophysikalische Charakterisierung von entwickelten Kapsiden und Virusvektoren mithilfe von DLS, MADLS, SEC-MALS, ITC und DSC die zuverlässige Beurteilung wichtiger Qualitätsmetriken und die Interpretation der Ergebnisse biochemischer und biologischer Assays durch Messungen von Kapsidgröße und -Titer, Aggregatbildung, vollständiger prozentualer Analyse, Rezeptorbindung, thermischer Stabilität und Kapsid-Uncoating.

Vorgestellte Lösungen

Prozessentwicklung für Gentherapien

Der Produktionsprozess für Gentherapien muss strenge gesetzliche Anforderungen und andere interne Erwartungen hinsichtlich Qualität, Zeitrahmen und Kosten erfüllen. Zweckmäßige Lösungen sind erforderlich, um den analytischen Workflow zu unterstützen und zu stärken und folgende Herausforderungen zu meistern: 

  • Hohe Produktkomplexität
  • Vielfalt der Virusvektoren für die Genübertragung bei Design und Entwicklung 
  • Suboptimale nachgelagerte Verarbeitung mit langwierigen analytischen Assays, die eine signifikante Variabilität aufweisen


Während der nachgelagerten Reinigung werden mehrere Assays durchgeführt, um die wichtigsten analytischen Attribute zu bestimmen, die die Ausbeute bestimmen, und Berichte über kritische Qualitätsmerkmale (CQAs) zu erstellen, z. B. Virusvektor-Reinheit, Wirkkraft, Stabilität und Sicherheit.  In der Regel werden unter anderem die folgenden Parameter untersucht:  

  • Kapsid-Titer oder Partikelanzahl
  • Genomanzahl
  • Prozentsatz der Viruspartikel mit Genomen oder vollständige Prozentanalyse
  • Serotypeigenschaften
  • Aggregatbildung 
  • Kontamination durch unerwünschte Host-Zell-Proteine und Nukleotide 


Die ersten drei Parameter (Kapsid-Titer, Genomanzahl, vollständige Prozentanalyse) werden häufig mit zwei oder mehr der folgenden Assays gemessen: qPCR, ddPCR, ELISA, AUC, HPLC-AEX und/oder TEM.  Jede Methode hat intrinsische Stärken und Schwächen in Bezug auf den gemessenen Parameter, den Durchsatz, die Geschwindigkeit, die Genauigkeit und Probenvolumenanforderungen. 

Gentherapie: charakterisieren, vergleichen, optimieren

In der Prozessentwicklung für Virusvektoren wie AAVs eignet sich der Zetasizer Ultra sehr gut als komplementärer Assay, der in bestehenden analytischen Arbeitsabläufen eingesetzt werden kann und eine schnelle, markerfreie, zerstörungsfreie und orthogonale Messung der gesamten Viruspartikelkonzentration, des Kapsid-Titers, der Kapsidgröße, der Ladung, der Aggregatbildung, der thermischen Stabilität und der Kapsid-Freilegung bei geringen Volumen bietet.

Eine genaue und präzise Größenanalyse ist für die Messung der Partikelkonzentration unerlässlich. Der Zetasizer Ultra nutzt drei Streuwinkel, um eine genauere Messung mit höherer Auflösung zu ermöglichen. Bei der dynamischen Mehrwinkellichtstreuung (MADLS) werden Streuungsinformationen von vorn, hinten und den Seiten erfasst und zu einer einzigen Größenverteilung mit höherer Auflösung zusammengefasst, die repräsentativere Daten liefert.

Die Größenausschluss-Chromatographie (SEC) wird seit langer Zeit als wichtiges Tool zur Messung des Molekulargewichts von Makromolekülen, Proteinen, Viren, Polysacchariden und Polymeren eingesetzt. OMNISEC, ein SEC-System mit Mehrfacherkennung, kann Daten zu mehreren wichtigen Analyse- und Qualitätsattributen von AAVs bereitstellen, z. B. Kapsid- und Genomtiter oder eine vollständige prozentuale Analyse – diese sind allein über die UV-Detektion nicht verfügbar. Diese wichtigen Parameter liefern entscheidende Informationen zu Virusvektor-Reinheit, Wirkstärke und Stabilität.

Die dynamische Differenzkalorimetrie (DSC) ist ein bewährtes Tool für die Charakterisierung und Entwicklung von virusbasierten Produkten, darunter auch verschiedener handelsüblicher Impfstoffe. Zusätzlich zu verschiedenen Stabilitätsmetriken für Virusvektoren bietet die DSC ein TM der Kapsid-Disintegration, das für eine Serotyp-Identifizierung charakteristisch ist. Das Tool liefert Informationen zur thermischen Stabilität, bildet die hochgeordnete Struktur ab und kann strukturelle Änderungen als Reaktion auf Belastungs-, Formulierungs- oder Prozesszustandsänderungen erkennen.

Stabilität und Funktion der Viruskapside bleiben in einem subtilen Gleichgewicht. Viruskapside müssen stabil genug sein, um das Genom zu umschließen und zu schützen, sich an die Oberfläche der Hostzelle für die zelluläre Aufnahme binden und durch das Zellmilieu navigieren. Ein virales Kapsid muss jedoch auch eine ausreichende Konformationslabilität aufweisen, um das Genom am Replikationsort freizusetzen.

Über den Mechanismus des AAV-Vektor-Uncoating ist nach wie vor nur wenig bekannt, aber für das Kapsid-Uncoating und die Genomfreisetzung scheinen strukturelle Veränderungen erforderlich zu sein.  Es wird angenommen, dass die Neigung des Virusvektors zum Uncoating mit einem wichtigen Qualitätsattribut korreliert – der Infektiosität. Die DSC kann in Verbindung mit thermischen Rampen der dynamischen Lichtstreuung zur Beurteilung der Uncoating-Neigung eines Viruskapsids als Reaktion auf Puffer- und Belastungsbedingungen verwendet werden.

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