Viren und ihre Derivate bieten zahlreiche Anwendungen in der Biomedizin, Bio- und Nanotechnologie. In der Gentherapie werden Viren als Vektoren verwendet, um modifizierte Gene in Zielzellen einzuschleusen, um dadurch eine Krankheit zu behandeln oder zu verhindern: 

  • Ersetzen eines mutierten Gens, welches eine Krankheit verursacht, durch eine gesunde Kopie des Gens
  • Inaktivierung oder " Ausschaltung " eines mutierten Gens, das nicht ordnungsgemäß funktioniert
  • Einführen eines neuen Gens in den Körper, um eine Krankheit zu bekämpfen oder ein Syndrom zu behandeln


Adenoviren, Retroviren, Lentiviren, Adeno-assoziierte Viren (AAVs) und andere tierische Viren werden seit mehreren Jahrzehnten für die Entwicklung von Gentherapien eingesetzt. In den letzten Jahren hat dieser Anwendungsbereich ein deutliches Wachstum erfahren, was vor allem auf die Entwicklungen in der rekombinanten AAV-Vektorentwicklung und -produktion für In-vivo-Gentherapien zurückzuführen ist.

Um wirksame Gentherapie-Vektoren zu entwickeln, die durch kontrollierte und wirtschaftliche Herstellungsprozessen gewonnen werden, müssen mehrere Herausforderungen bewältigt werden.  Diese reichen vom Capsid-Design über die Identifizierung optimaler Prozess- und Formulierungsbedingungen bis hin zu einer umfassenden Qualitätskontrolle der Wirkstoffe und Arzneimittelprodukte.

Anwendung der Malvern Panalytical Systemlösungen im gesamten Workflow der in vivo Gentherapieentwicklung

Vom Kapsiddesign über die Optimierung der Downstream-Prozessbedingungen bis hin zu Formulierungs- und Stabilitätstests und der erweiterten Charakterisierung von Wirkstoffen und Arzneimittelprodukten werden Technologien wie Dynamische Lichtstreuung (DLS), Elektrophoretische Lichtstreuung (ELS), Dynamische Mehrwinkel-Lichtstreuung (MADLS), Größenausschluss-Chromatographie gekoppelt mit Mehrwinkel-Lichtstreuung (SEC-MALS), Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA), isothermische Titrationskalorimetrie  (ITC) und dynamische Differenzkalorimetrie (DSC) eingesetzt, um Wissenschaftlern über die wichtigsten analytischen und qualitativen Eigenschaften von viralen Vektoren zu informieren. Dies ermöglicht die Charakterisierung, den Vergleich und die Optimierung von:

  • Capsidgröße (DLS, SEC, NTA)
  • Capsid-Titer oder Partikelanzahl (MADLS, SEC, NTA)
  • Prozentualer Anteil genomhaltiger Viruspartikel / % Vollanalyse (SEC
  • Aggregatbildung (DLS, MADLS, SEC, NTA)
  • Fragmentierung (SEC)
  • Thermische Stabilität (DLS, DSC)
  • Strukturanalyse höherer Ordnung (DSC)
  • Serotyp-Identifizierung (DSC)
  • Capsid-Uncoating und Genom-Ausstoß (DLS und DSC)
  • Bindung an Rezeptor (ITC)
  • Ladung (ELS)


DLS, MADLS, SEC-MALS, NTA, ITC und DSC sind markierungsfreie biophysikalische Techniken, die nur eine minimale Versuchsentwicklung erfordern und problemlos in allen Stadien angewandt werden können, wodurch der analytische Arbeitsablauf für die Gentherapieentwicklung optimiert wird.

Empfohlene Lösungen

Empfohlene Technologien

Forschung und frühe Entwicklung: virales Kapsiddesign

Obwohl der Entdeckungsprozess in der Gentherapie schneller abläuft als in der traditionellen Medikamentenentwicklung, bringt der hohe Grad an Produktkomplexität zusätzliche Herausforderungen mit sich, die frühzeitig bewältigt werden müssen, um die Bereitstellung von sicheren und wirksamen Produkten zu gewährleisten. Zu diesen Herausforderungen gehören:

  • Auswahl eines viralen Kapsids basierend auf optimalen Eigenschaften und Funktionen
  • Rationales Protein-Engineering zur Verbesserung und Modifizierung der Eigenschaften und Funktionalitäten des ursprünglichen viralen Kapsids


Die Lösungen basieren in beiden Fällen auf einem umfassenden Satz von physikalisch-chemischen, biochemischen und biologischen Daten, die Aufschluss über die Leistungsfähigkeit des viralen Vektors geben und in den Auswahlprozess einfließen. 

In diesem Stadium unterstützt die umfassende biophysikalische Charakterisierung der konstruierten Kapside und viralen Vektoren mittels DLS, MADLS, SEC-MALS, ITC und DSC die zuverlässige Bewertung wichtiger Qualitätsmerkmale. Die Interpretation der Ergebnisse biochemischer und biologischer Testverfahren erfolgt durch Messungen der Kapside in Bezug auf Größe und Titer, Aggregatbildung, %-Vollmessung, Rezeptorbindung, thermische Stabilität und Neigung zum Kapsid Uncoating.

Empfohlene Lösungen

Die Prozessentwicklung in der Gentherapie

Der Herstellungsprozess der Gentherapie muss strenge behördliche Anforderungen und andere interne Erwartungen an Qualität, Zeitrahmen und Kosten erfüllen. Zur Unterstützung und Stärkung des analytischen Arbeitsablaufes und zur Bewältigung der damit verbundenen Herausforderungen werden geeignete Maßnahmen benötigt. Zu diesen Herausforderungen zählen:

  • Hoher Grad an Produktkomplexität
  • Vielfalt an viralen Vektoren für den Gentransport in Design und Entwicklung 
  • Suboptimale Weiterverarbeitungsprozesse mit langwierigen analytischen Tests, die unter erheblichen Schwankungen leiden


Während der gesamten Weiterverarbeitungsprozesse werden mehrere Tests durchgeführt, um die wichtigsten analytischen Parameter des viralen Vektors zu bestimmen, die die Ausbeute beeinflussen und über kritische Qualitätsattribute (CQAs) wie Reinheit, Potenz, Stabilität und Sicherheit Aufschluss geben. Diese Parameter sind typischerweise, aber nicht ausschließlich, die folgenden:  

  • Kapsid-Titer oder Partikelanzahl
  • Genom-Anzahl
  • Prozentsatz der genomhaltigen Viruspartikel oder % Vollanalyse
  • Charakterisierung des Serotyps
  • Aggregatbildung 
  • Kontamination durch unerwünschte Wirtszellproteine und Nukleotide 


Die ersten drei Parameter (Kapsid-Titer, Genomanzahl, % Vollanalyse) werden üblicherweise mit zwei oder mehreren der folgenden Verfahren gemessen: qPCR, ddPCR, ELISA, AUC, HPLC-AEX, und/oder TEM. Jede Methode hat ihre eigenen Stärken und Schwächen in Bezug auf den gemessenen Parameter, den Durchsatz, die Geschwindigkeit, die Genauigkeit und das erforderliche Probenvolumen.

Gentherapie: charakterisieren, vergleichen, optimieren

Bei der Prozessentwicklung für virale Vektoren wie AAVs eignet sich der Zetasizer Ultra gut als ergänzender Assay, der in bestehenden analytischen Arbeitsabläufen eingesetzt werden kann. Er bietet eine schnelle, markierung- und zerstörungsfreie, volumenarme und orthogonale Messung der gesamten Viruspartikelkonzentration, des Kapsid-Titers, der Kapsidgröße, der Ladung, der Aggregatbildung, der thermischen Stabilität und des Kapsid Uncoatings.

Eine genaue und präzise Partikelgrößenanalyse ist für die Messung der Partikelkonzentration unerlässlich. Der Zetasizer Ultra nutzt drei Streuwinkel, um eine präzisere und höher aufgelöste Messung zu ermöglichen. Bei der dynamischen Mehrwinkellichtstreuung (Multi-Angle Dynamic Light Scattering, MADLS) werden Streuinformationen aus Rück-, Seiten- und Vorwärtswinkeln gesammelt und zu einer einzigen, höher aufgelösten Größenverteilung kombiniert, die repräsentativere Daten liefert.

Die Größenausschlusschromatographie (SEC) wird seit langem als wichtiges Werkzeug zur Messung des Molekulargewichts von Makromolekülen, Proteinen, Viren, Polysacchariden und Polymeren eingesetzt. OMNISEC, ein Multi-Detektions-SEC-System, kann Daten zu mehreren wichtigen analytischen und qualitätsrelevanten Parametern von AAVs liefern, wie z. B. den Kapsid- und Genom-Titer und auch den Anteil an gefüllten Kapsiden (% voll) - diese Parameter sind über die reine UV-Detektion nicht zugänglich. Diese wichtigen Messgrößen liefern entscheidende Informationen über die Reinheit, Potenz und Stabilität von viralen Vektoren.

Die dynamische Differenzkalorimetrie (DSC) ist ein weit etabliertes Werkzeug bei der Charakterisierung und Entwicklung von virusbasierten Produkten, einschließlich mehrerer kommerzieller Impfstoffe. Die dynamische Differenzkalorimetrie (DSC) ist ein weit etabliertes Werkzeug bei der Charakterisierung und Entwicklung von virusbasierten Produkten, einschließlich mehrerer kommerzieller Impfstoffe. Zusätzlich zu mehreren Stabilitätskriterien für virale Vektoren liefert die DSC eine Schmelztemperatur (TM) des Kapsidzerfalls, die für eine Serotyp-ID charakteristisch ist. Sie zeigt die thermische Stabilität an, erstellt einen probenspezifischen Verlauf von Strukturen höherer Ordnung und kann strukturelle Veränderungen als Reaktion auf Stress, Änderungen der Formulierung oder Prozessbedingungen erkennen.

Die virale Kapsidstabilität und ihre Funktion befinden sich in einem feinen Gleichgewicht. Virale Kapside müssen stabil genug sein, um das Genom zu enthalten und zu schützen, an die Oberfläche der Wirtszelle zu binden, um von der Zelle aufgenommen zu werden und sich im zellulären Milieu zurechtzufinden. Allerdings muss ein virales Kapsid auch genügend Konformationslabilität bieten, um das Genom an der Replikationsstelle freizugeben.

Der Mechanismus des AAV-Vektoren Uncoatings bleibt schlecht verstanden, aber eine strukturelle Veränderung scheint für die Kapsidenthüllung und die Genomfreisetzung erforderlich zu sein. Es wird postuliert, dass die Neigung des Vektors, sich zu entfalten, mit einem wichtigen Qualitätsmerkmal korreliert - der Infektiosität. Die DSC kann in Verbindung mit thermischen Rampen der dynamischen Lichtstreuung verwendet werden, um die Bereitschaft zur Entfaltung eines viralen Kapsids als Reaktion auf Puffer- und Stressbedingungen zu beurteilen.

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