등온 적정 열량측정법(ITC)은 다양한 생체 분자 상호 작용의 정량적 연구에 사용됩니다. 생체 분자 결합 작용 동안 방출되거나 흡수된 열을 직접 측정 하여 작동합니다.

ITC는 단일 실험에서 결합 매개 변수를 동시에 측정할 수 있는 유일한 기법입니다. 고정화 또는 형광 태그를 사용하여 결합 파트너를 변경할 필요 없이 ITC는 네이티브 상태에서 결합 파트너의 친화도를 측정합니다.

결합 중 열 전달을 측정하면 결합 상수(KD), 반응 화학량론(n), 엔탈피(∆H) 및 엔트로피(ΔS)를 정확하게 측정할 수 있습니다. 이를 통해 분자 상호 작용에 대한 완전한 열역학적 프로필을 제공합니다. ITC는 결합 친화도를 측정하고 분자 상호 작용의 바탕이 되는 메카니즘을 해석할 수 있습니다. 구조와 기능 간의 관계를 자세히 이해하면 최고의 선택 및 최적화와 관련하여 확신을 가지고 의사를 결정할 수 있습니다.

측정 원리

등온 적정 열량측정법은 생체 분자 간 반응 측정에 사용됩니다. 표지를 사용할 필요 없이 이 방법으로 결합 친화도, 화학량론, 용액의 결합 반응에 대한 엔트로피와 엔탈피를 측정할 수 있습니다.

결합이 일어날 때 열이 흡수되거나 방출되고 이러한 열은 관심 있는 생체 분자가 포함된 시료 셀에서 리간드의 점진적인 적정 중에 민감한 열량측정계로 측정합니다.

작동 방법

열 코어

미세 열랑측정계에는 두 개의 셀이 있는데, 한 셀에는 물이 포함되어 있고 기준 셀 역할을 하며 다른 셀에는 시료가 포함되어 있습니다. 미세 열랑측정계는 두 셀을 동일한 온도로 유지해야 합니다. 열 감지 장치는 결합이 일어날 때 셀 간의 온도차를 감지하여 가열기에 피드백을 제공하므로 이 온도차가 보정되어 셀은 다시 동일한 온도가 됩니다.

측정하기

기준 셀과 시료 셀을 원하는 실험 온도로 설정합니다. 아주 정밀한 주입 장치에 있는 시린지에 리간드를 로드합니다. 이 주입 장치는 관심 있는 단백질이 포함된 시료 셀에 삽입합니다. 리간드의 부분 시료 소량을 단백질 용액에 주입합니다. 단백질에 대한 리간드 결합이 존재하는 경우 몇 100만분의 1도의 열 변화를 감지하고 측정합니다.

첫 주입이 이루어지면 미세 열랑측정계는 결합 반응이 평형 상태에 도달할 때까지 방출된 열을 측정합니다.  측정된 발열량은 결합량에 정비례합니다.

결과 및 데이터 분석

아래 예에서 이 반응은 발열 반응이고, 시료 셀이 기준 셀보다 따뜻해져 신호의 피크가 아래로 향하게 됩니다. 두 셀의 온도가 다시 동일해지면 신호는 시작 위치로 돌아갑니다. 리간드의 2차 부분시료 소량을 시료 셀에 주입하고 미세 열랑측정계는 감지된 작은 열 변화를 다시 보정합니다. 일련의 리간드 주입을 통해 리간드와 단백질 간의 분자비가 점진적으로 증가합니다. 단백질이 점점 포화될 수록 리간드에 대한 결합이 적게 일어나고 궁극적으로 시료 셀에 과량의 리간드 대비 단백질이 포함될 때까지 열 변화가 감소하기 시작하며 이 반응은 포화 상태에 이르게 됩니다.

단백질과 리간드의 분자비에 대해 각 피크 영역이 통합되고 플롯됩니다. 등온선은 친화도(KD)에서 도출된 결합 모델에 맞추어 조정할 수 있습니다. 결합 등온선 중앙의 분자비는 반응 화학량론을 제공합니다. 아래에 제시된 도표는 1:1 결합 반응의 예입니다.

엔탈피(ΔH)는 등온선에서 직접 도출되고 리간드 결합에 대한 몰당 발열량입니다. 즉, 단일 ITC 실험은 결합 반응에 대한 많은 정보를 제공하므로 이를 통해 상호 작용의 특성을 파악하고 열역학적 요소를 알아볼 수 있습니다.

ITC는 다음을 위한 약물 발견과 개발에 널리 사용됩니다.

  • 결합 친화도 정량화
  • 후보 물질 선택과 최적화
  • 열역학적 조건과 활성 농도의 측정
  • 작용 메커니즘의 특성 분석
  • 저분자 약물 발견 시 의도한 결합 대상 확인
  • 결합 특이성 및 화학량론의 측정
  • 유효 물질의 선도 물질화 과정 중 IC50 및 EC50 값 검증
  • 효소 반응 속도 측정