A triagem biofísica de bibliotecas compostas para a identificação de ligantes que interagem com uma proteína é eficiente, mas normalmente não revela se (ou como) os ligantes podem interferir em suas propriedades funcionais. Para isso, é necessário um ensaio bioquímico/funcional. Mas para proteínas cuja função depende de uma mudança conformacional, tais ensaios são normalmente complexos ou têm baixa produtividade.
Aqui, exploramos um biossensor de geração de segundo harmônico (SHG) de alta produtividade para detectar fragmentos que induzem alterações conformacionais ao ligar a uma proteína em tempo real e identificar regiões dinâmicas. Os ensaios de SHG em formato de placa multipoços foram desenvolvidos para mutantes de tipo selvagem e seis mutantes modificados de cisteína única de proteína de ligação da acetilcolina (AChBP), um homólogo para os canais de íons ligantes integrados (LGICs). Eles foram conjugados com rótulos ativos de segundo harmônico via acoplamento de amina ou maleimida.
A triagem biofísica de bibliotecas compostas para a identificação de ligantes que interagem com uma proteína é eficiente, mas normalmente não revela se (ou como) os ligantes podem interferir em suas propriedades funcionais. Para isso, é necessário um ensaio bioquímico/funcional. Mas para proteínas cuja função depende de uma mudança conformacional, tais ensaios são normalmente complexos ou têm baixa produtividade.
Aqui, exploramos um biossensor de geração de segundo harmônico (SHG) de alta produtividade para detectar fragmentos que induzem alterações conformacionais ao ligar a uma proteína em tempo real e identificar regiões dinâmicas. Os ensaios de SHG em formato de placa multipoços foram desenvolvidos para mutantes de tipo selvagem e seis mutantes modificados de cisteína única de proteína de ligação da acetilcolina (AChBP), um homólogo para os canais de íons ligantes integrados (LGICs). Eles foram conjugados com rótulos ativos de segundo harmônico via acoplamento de amina ou maleimida.
Para validar o ensaio, confirmou-se que as alterações conformacionais induzidas na AChBP pelos agonistas do receptor nicotínico de acetilcolina (nAChR) e antagonistas foram qualitativamente diferentes. Uma biblioteca de 1056 fragmentos foi posteriormente rastreada contra todas as variantes e moduladores conformacionais de AChBP foram identificados com sucesso, com taxas de acertos de 9 a 22%, dependendo da variante de AChBP. Um subconjunto de quatro acertos foi selecionado para validação ortogonal e análise estrutural. Um ensaio de biossensor baseado em Interferometria acoplado a grade, com resolução temporal, confirmou a interação como sendo reversível em interação 1: 1 de 1 etapa e forneceu estimativas de afinidades e constantes da taxa cinética da interação (KD = 0,28–63 μM, ka = 0,1–6 μM−1 s−1, kd = 1 s−1). A cristalografia por raios X de dois dos fragmentos confirmou sua ligação em um local conformacionalmente dinâmico descrito anteriormente, correspondente ao local regulatório dos LGICs.
Esses resultados revelam que a SHG tem sensibilidade para identificar fragmentos que induzem alterações conformacionais em uma proteína. Foi caracterizada e confirmada uma seleção de acertos de fragmentos com um perfil de resposta diferente dos reguladores LGIC conhecidos para ligação a regiões dinâmicas da proteína.
