Uma introdução básica à Espalhamento de Luz Dinâmico (DLS) para análise de tamanho de partículas – Perguntas e Respostas

O valor do intercepto é a razão sinal/fundo e o valor vai variar de acordo com a amostra e a configuração óptica do instrumento. Valores apropriados estão entre 10% e 100% (ou seja, 0.1 a 1.0). Um valor menor que o esperado pode indicar uma concentração de amostra muito alta ou muito baixa, absorção ou fluorescência da amostra. Uma concentração de amostra muito alta pode levar a efeitos de espalhamento múltiplo que irão reduzir o valor do intercepto. A configuração NIBS do Zetasizer Nano S/ZS/ZSP permite que o comprimento de caminho do feixe de laser seja minimizado, o que, por sua vez, irá minimizar qualquer espalhamento múltiplo presente. Se houver um baixo espalhamento de excesso, ou seja, a diferença no espalhamento entre o dispersante e as partículas dispersas no dispersante, então o intercepto será baixo. A presença de fluorescência ou absorção da amostra também pode reduzir o intercepto. No caso de fluorescência, há a opção de instalar um filtro de banda estreita no instrumento que removerá qualquer luz fluorescente presente.

DLS mede as flutuações dependentes do tempo na intensidade da luz espalhada e, portanto, as informações fundamentais obtidas da técnica são baseadas na intensidade da luz espalhada. O diâmetro z-médio é o diâmetro médio ponderado pela intensidade obtido a partir da análise de cumulantes conforme definido na ISO22412 (2017) e a distribuição de tamanho primária é baseada na intensidade.

Embora a transformação da distribuição de intensidade medida para volume ou número pareça direta, os usuários de DLS são fortemente advertidos a não sobrecarregarem a análise dos resultados. A técnica DLS tende a superestimar a largura dos picos na distribuição e esse efeito é ampliado nas transformações para volume e número. As distribuições de tamanho de volume e número devem ser usadas apenas para estimar as quantidades relativas de material em picos separados, pois as médias e, particularmente, as larguras são menos confiáveis. Portanto, é recomendado usar a distribuição de tamanho por intensidade para reportar o tamanho de cada modo na distribuição, mas usar os dados de volume ou número para reportar as quantidades relativas de cada família de partículas na amostra.

O espalhamento de luz dinâmico mede as flutuações dependentes do tempo na intensidade da luz espalhada, o que permite a determinação dos coeficientes de difusão translacional (ou seja, movimento browniano) e, portanto, o tamanho das partículas/moléculas.

O espalhamento de luz estático mede a intensidade média no tempo da luz espalhada. Na linha de produtos Zetasizer, a intensidade média no tempo da luz espalhada é medida como uma função da concentração da amostra (ou seja, soluções moleculares) e, a partir disso, o peso molecular absoluto de uma solução macromolecular é determinado. Na linha de produtos Mastersizer, a intensidade média no tempo da luz espalhada é medida em função do ângulo e isso permite a determinação do tamanho das partículas.

A resposta para essa pergunta é sim, pode depender. DLS assume que as partículas/moléculas sendo medidas estão em movimento browniano, aleatório. Isso é verdade em uma concentração de amostra diluída. No entanto, à medida que a concentração da amostra aumenta, outros efeitos podem ocorrer, como espalhamento múltiplo, difusão restrita e interações partícula-partícula. Enquanto a influência do espalhamento múltiplo pode ser minimizada usando detecção de retroespalhamento e medindo próximo à parede da cuba, a difusão restrita e as interações partícula-partícula são mais problemáticas de entender. Normalmente, a difusão restrita pode ser compensada usando a viscosidade da amostra, em vez do dispersante. As interações partícula-partícula são muito mais complexas e não podem ser compensadas.

O tamanho obtido de uma medição DLS deve ser independente da concentração da amostra (ISO22412 (2017)). No entanto, quando o tamanho obtido para qualquer amostra é dependente da concentração da amostra, uma série de diluição deve ser realizada e o coeficiente de difusão medido de cada concentração de amostra deve ser plotado como uma função da concentração e os dados extrapolados para concentração zero. O valor obtido na concentração zero é o coeficiente de difusão verdadeiro (ou seja, tamanho médio) da amostra. Isso é conhecido como um gráfico de Debye dinâmico e é discutido na ISO22412 (2017). Se você tem a chave de recurso avançado de proteínas instalada com o seu software Zetasizer, os Calculadores contêm um gráfico de Debye dinâmico.

Eu anexei alguns documentos que discutem os efeitos da concentração em mais detalhes.
Aplicação do Espalhamento de Luz Dinâmico (DLS) a Formulações Terapêuticas de Proteínas: Princípios, Medições e Análise – 2. Efeitos de Concentração e Interações de Partículas
FAQ – O que é espalhamento múltiplo?
FAQ – O que é difusão restrita?

O limite inferior de tamanho do espalhamento de luz dinâmico depende de muitos fatores, como a configuração óptica do instrumento, comprimento de onda/potência do laser, sensibilidade do detector, concentração da amostra e nível de excesso de espalhamento. Este último ponto é a diferença no espalhamento entre o dispersante usado e a molécula/partículas no dispersante. Quanto maior o nível de excesso de espalhamento, mais fácil é medir. O menor tamanho que medimos em um Zetasizer é 0,6 nm (modo de pico) e eu anexei uma nota de aplicação que fornece detalhes de tais medições.

Nota de aplicação “Medindo Tamanhos Subnanométricos Usando Espalhamento de Luz Dinâmico“

Isso geralmente significa que sua amostra contém partículas/agregados/poeira muito grandes que estão causando interferência nas medições. Nós nos referimos a isso como flutuações numéricas e eu anexei um FAQ que discute isso em mais detalhes. O certo é que a amostra não é adequada para DLS e que o material grande deve ser removido antes que as medições sejam feitas.

FAQ – O que são flutuações numéricas?