Temperatura de Agregação (Tagg) – o que é e como podemos calculá-la?

Medição da temperatura de agregação usando o Zetasizer

Na espelhamento de luz dinâmico (DLS), o tamanho hidrodinâmico e a distribuição de tamanho das partículas em solução podem ser obtidos. Pode ser interessante examinar essa medição como uma função do tempo e temperatura, ou como uma ‘tendência’, como é chamado no software Zetasizer da Malvern. Para amostras de proteínas biológicas, essa tendência de temperatura é particularmente interessante: embora a baixas temperaturas uma proteína possa ser estável e mostrar medições de tamanho (e intensidade de espelhamento) repetíveis, tipicamente a uma temperatura elevada (T_agg), moléculas de proteína tendem a oligomerizar ou agregar. A temperatura em que isso ocorre depende da própria proteína e da composição do tampão, e geralmente é observada claramente quando a proteína inicial é homogênea no início da medição.

Um exemplo, discutindo a estabilidade da albumina humana recombinante, é discutido na nota de aplicação, “Usando espelhamento de luz para estudar a estabilidade térmica da Recombumin – prevendo a vida útil“.

Como o T_agg é determinado?

O método tradicional para determinar a temperatura de agregação T_agg era observar a intensidade normalizada versus temperatura. O ponto de agregação era o primeiro ponto em que a inclinação era maior que 10, onde a inclinação inclui os 5 pontos de dados anteriores. Este método pode ser modificado para olhar o tamanho médio z, ou até mesmo o índice de polidispersidade. O software atual contém dois algoritmos de ajuste:

• análise de parâmetro único (somente taxa de contagem)
• análise de múltiplos parâmetros (tamanho e taxa de contagem)

O ajuste de múltiplos parâmetros considera tanto a mudança no tamanho hidrodinâmico (tamanho médio-z) quanto a taxa de contagem de espelhamento (derivada) e é o método preferido. Uma captura de tela do software atual mostra uma diferença típica entre os dois métodos de análise.

Como exemplo para o ponto de temperatura de agregação da hemoglobina fornecido no arquivo Example Results.dts, o método antigo de parâmetro único deu um resultado de 38ºC, enquanto o novo método de múltiplos parâmetros deu um resultado de 42ºC. A mudança absoluta não é uma grande preocupação, desde que o mesmo método seja utilizado ao comparar diferentes conjuntos de dados. Para ver este menu para qualquer conjunto de dados, destaque um registro, clique com o botão direito e selecione editar resultado.

Por que T_agg é diferente de T_melt?

A temperatura de agregação detecta o início da agregação; a temperatura em que as moléculas tendem a se agregar. A temperatura de fusão, T_melt ou T_m, por outro lado, é o resultado da desnaturação (quase) completa da proteína. Pode, por exemplo, ser determinada por calorimetria de varredura diferencial (DSC) ou com dicroísmo circular (CD), que podem detectar, respectivamente, pequenas mudanças na capacidade térmica e estrutura total. Devido à extrema sensibilidade do espelhamento de luz a pequenas mudanças de tamanho molecular e ao início da oligomerização, a temperatura de agregação (T_agg) é tipicamente considerada inferior à temperatura de fusão (T_melt).

Como configurar uma medição para T_agg ?

O Zetasizer permite medições automatizadas de tendência versus temperatura. Para acessar o menu, basta iniciar uma medição manual ou criar um SOP. Em seguida, selecione no canto superior esquerdo da janela Tipo de Medição – Tendência – Temperatura – Tamanho, que começará com algumas configurações padrão. Percorra os itens do menu, em particular a sequência de tendência, onde a temperatura inicial e final bem como o intervalo de temperatura podem ser inseridos. Marque a opção “verificar ponto de agregação”. Nas configurações de “Medição de tamanho”, forneça o tempo de equilíbrio em cada etapa. Recomendo marcar a opção “permitir que os resultados sejam salvos contendo apenas dados de correlação”. Isso irá mesmo salvar os dados quando a amostra estiver bastante agregada (ou seja, além da temperatura de agregação) e pode ser útil ter.

O SOP estima o tempo de experimento e isso é exibido na seção de tendência e medições de tamanho (pode ser necessário clicar em outra coisa para atualizar o cálculo). O SOP ou a medição manual pode então ser iniciada como uma medição regular.

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