Princípios Básicos da Análise de Rastreamento de Nanopartículas – Perguntas e Respostas

O NTA fornece uma distribuição ponderada pelo número porque é uma análise partícula por partícula. O DLS naturalmente fornece uma distribuição ponderada pela intensidade, que pode ser convertida para ponderada pelo volume, depois novamente para ponderada pelo número. Nos guias da ASTM, há uma orientação específica de que a distribuição baseada em número derivada do DLS está sujeita a grandes imprecisões e não é recomendada para uso rotineiro. O NTA é naturalmente uma técnica baseada em número, então a mesma amostra nessas duas técnicas pode mostrar resultados um pouco diferentes.

Consulte nossa nota técnica sobre Comparação de Medidas Estatísticas Relatadas pelas Técnicas NTA e DLS.

Também temos um white paper comparando os resultados de NTA e DLS em uma gama de tipos de amostras. Isso deve dar uma ideia melhor de como ambas as técnicas se complementam.

O NTA não ajusta os dados a nenhuma forma de pico específica, ajusta as distribuições de tamanho após a análise ou favorece diferentes partes do intervalo de tamanho. Os histogramas são apenas uma exibição de todas as partículas individuais após o tamanho delas ter sido analisado. Como nossos dados básicos são uma população de partículas únicas, todas as medidas estatísticas são estatísticas populacionais diretas em vez de interpolações de uma distribuição derivada.

A diluição provavelmente será necessária, a menos que você tenha uma amostra que seja muito esparsa desde o início. Se você está familiarizado com as medições de DLS, geralmente estamos 10-1000x mais diluídos do que isso. Idealmente, na faixa de 10^7 a 10^9 partículas/ml.

Emulsões na faixa de tamanho submicrométrico são certamente adequadas para esta técnica. Contanto que as amostras sejam diluídas com um líquido apropriado que mantenha a estabilidade das gotículas, a medição deve ser bastante fácil.

Monômeros de proteína estão bem abaixo do limite inferior de detecção desta técnica, mas monitorar a agregação de proteínas é uma aplicação forte para esses instrumentos devido à sua capacidade com distribuições polidispersas e para fornecer uma concentração dos agregados que são medidos. Nossa nota de aplicação sobre agregação de proteínas deve fornecer um pouco mais de informações.

A natureza da medição fornece o diâmetro hidrodinâmico, ou seja, o tamanho do objeto se movendo no líquido. Quando qualquer coisa de tamanho significativo é adicionada à superfície da partícula primária, isso afeta o movimento da partícula no líquido, e portanto o tamanho que é relatado. Adicionar surfactantes ou anticorpos à superfície da partícula deve ser suficiente para mostrar uma mudança no tamanho relatado por uma quantidade igual ao tamanho das moléculas anexadas. Mudanças de tamanho tão pequenas quanto três nanômetros foram observadas de forma confiável em alguns experimentos com revestimento/não revestimento.

DLS e NTA/NanoSight responderão da mesma maneira, já que o movimento browniano em que ambas as técnicas confiam será afetado na mesma medida. O NTA pode ser ligeiramente mais confiável em mostrar essa mudança, pois pode medir as partículas primárias com precisão, independentemente de qualquer outra coisa que possa estar na amostra.

Outra técnica a considerar para esta aplicação é a Medição de Massa de Ressonância (RMM), conforme representada pelo produto Archimedes da Malvern. Se as partículas primárias estiverem dentro da faixa de medição da técnica, a sensibilidade de massa desta técnica significa que a mudança devido ao revestimento será facilmente medida.

A equação de Stokes-Einstein exige que as variáveis de temperatura e viscosidade sejam inseridas. Para qualquer diluente à base de água, a viscosidade pode ser lida automaticamente a partir da tabela de valores dependentes de temperatura. A temperatura é medida na célula de amostra e lida automaticamente pelo software para a maioria dos modelos NanoSight. Portanto, a menos que o diluente seja significativamente diferente da água, o usuário não precisará inserir manualmente nenhum valor.

Comparar duas técnicas diferentes poderia levar muitas páginas, mas vou resumir as principais diferenças. Mais importante, você deve considerar o que está tentando aprender sobre sua amostra e qual técnica pode ser mais sensível para isso.

NTA e TRPS são frequentemente considerados juntos porque têm faixas de medição e parâmetros semelhantes. O NTA tem um limite inferior de detecção, sendo capaz de ver a distribuição de tamanho completo para amostras que se estendem bem abaixo de 100nm. O NTA não requer uma solução eletrolítica forte, o que pode interferir na estabilidade de algumas amostras. As amostras podem ser medidas em qualquer diluente à base de água ou em uma ampla gama de solventes orgânicos. O poro de detecção TRPS deve ser calibrado frequentemente para resultados precisos e é suscetível a entupimentos. Como cada partícula é puxada uma de cada vez, tem o potencial de ser uma técnica de resolução mais alta. O NTA é geralmente mais flexível, tem uma faixa de aplicação mais ampla, é muito mais rápido e mais reprodutível para usar na prática, tem a capacidade de trabalhar em modo de fluorescência, e é mais amplamente aceito na comunidade científica devido a essas maiores capacidades.

Se você estiver considerando essas técnicas, gostaríamos de ter a oportunidade de testar algumas amostras para mostrar do que o sistema é capaz. Todas as técnicas têm pontos fortes e fracos, conforme evidenciado pela gama de técnicas no portfólio da Malvern.

Talvez dividindo em detalhes sobre semântica, mas o NTA não é uma técnica que requer calibração por si só. Padrões devem ser executados rotineiramente para verificar a operação correta e verificar o desvio a longo prazo. Se esses resultados estiverem fora da especificação ou mostrarem desvio, entre em contato com o serviço de suporte da Malvern. Acesse o procedimento detalhado para os padrões de látex de poliestireno que são mais comumente usados para saber mais.

Sim, o modelo NanoSight NS500 tem a capacidade de medir potencial zeta em uma base partícula por partícula. Nossa nota técnica fornece alguns detalhes sobre o processo. Se você deseja caracterizar componentes individuais em um material misto ou se o potencial zeta é uma maneira de caracterizar uma mudança na amostra, isso pode ser uma alternativa valiosa ao potencial zeta de espalhamento de luz eletroforético tradicional usado nos modelos Zetasizer da Malvern.

A resposta simples é qualquer configuração que permita que as partículas permaneçam no campo de visão por 5-10 segundos. Isso depende de qual modelo de instrumento e placa superior estão sendo usados. Mais detalhes e faixas de velocidade recomendadas estão em nossa nota técnica sobre análises de modo de fluxo.

Trabalhei com várias amostras de argila e ambientais. Para muitas amostras de água ambientais, as amostras são frequentemente medidas como recebidas, geralmente com algum nível de diluição. Se você estiver partindo de qualquer tipo de pó seco, geralmente haverá algum esforço necessário para dispersá-los em um líquido para chegar a partículas primárias (não aglomerados). Algum surfactante seria necessário (por exemplo, polimetafosfato de sódio) e energia mecânica como sonicação. Dependendo do seu objetivo (medindo aglomerados ou partículas primárias) determinaria qual estratégia você segue e quanta energia você deseja aplicar.

A câmara de amostras do NanoSight é fechada, então a evaporação/precipitação teria que ser feita externamente, e então injetada na célula de amostra. As medições podem ser tão rápidas quanto alguns segundos se você precisar apenas de uma rápida estimativa do tamanho. De um vaso de reação para a câmara de medição é apenas uma questão de carregar uma seringa e inseri-la no instrumento, então pode ser uma resposta rápida.

O NTA não é capaz de ver a forma da partícula. Todas as partículas aparecerão como um ponto de luz e o sistema apenas analisa o movimento desse ponto de luz. Uma partícula de alta razão de aspecto pode gerar um ponto de luz que não é perfeitamente redondo, mas também gira e flutua, então não há informação consistente para se trabalhar. A saída é um diâmetro esférico equivalente, ou seja, uma esfera que tem um volume equivalente à partícula que está sendo medida. Se duas amostras de haste de diferentes comprimentos forem medidas, o diâmetro esférico equivalente mostraria uma diferença relativa à diferença no volume da partícula.

Esferas e hastes podem ser medidas juntas em uma amostra, mas a única maneira de distingui-las seria se os dois diâmetros esféricos equivalentes forem suficientemente diferentes um do outro.

Para alterar a viscosidade, abra os arquivos que deseja alterar. Eles devem estar destacados em azul como abaixo. Clique em Alterar Configurações>Viscosidade, desmarque a caixa e depois clique duas vezes onde diz ÁGUA na imagem agora. Em seguida, você pode inserir a viscosidade em cP. Clique em Atualizar e ele deve reprocessar e mostrar os dados ajustados. Você precisará Exportar Resultados se quiser planilhas atualizadas ou relatórios em PDF.

Dos arquivos de planilha de resumo que exportamos, basta inserir>gráfico>gráfico de linhas, selecione a coluna ‘concentração’ como os dados reais. O centro do bin será os rótulos do eixo x.

O limiar de detecção correto dependerá do tipo de amostra e de como o vídeo foi coletado. Se você ajustar o nível da câmera para que todas as partículas sejam visíveis, mas as maiores partículas não sejam saturadas (se esse compromisso for possível), geralmente resulta nas análises sendo executadas com o limiar de detecção padrão de 5.

A lógica é fazer o limiar baixo o suficiente para que todas as partículas sejam marcadas com a cruz vermelha, mas não tão baixo a ponto de marcar ruído óptico e efeitos de fundo. A imagem a seguir é do manual e ilustra esses dois lados da questão.

Para ter uma boa noção do efeito de mudar o limiar de detecção, pegue um vídeo e analise-o várias vezes com limiares de detecção diferentes. Até que você vá obviamente longe demais em uma direção, os resultados não mudam muito com pequenas diferenças na configuração. Ser capaz de assistir as partículas sendo rastreadas em uma tela deve tornar óbvio quando estamos perdendo partículas ou captando ruído.

Não temos um procedimento documentado, mas recomendo este post de blog.

O DLS pode medir a maioria dos materiais para tamanhos abaixo de 1 nm, mas o NTA também é muito capaz na faixa de <80 nm. Dependendo do índice de refração do material, o limite inferior pode ser ~10 nm para metais, cerca de 30 nm para polímeros e ~40 nm para lipossomas. Desde que possamos ver as partículas, então a análise dessa imagem para determinação de tamanho é fácil e robusta.

O NTA não conseguirá ver partículas dentro de outro objeto. A dispersão de luz necessária para ver as nanopartículas será dispersa da superfície da célula e isso será a única coisa captada pela câmera. Uma técnica microscópica direta seria necessária para ver as partículas internalizadas.