Configurar o conjunto de colunas GPC/SEC mais adequado para a amostra

Se você já trabalhou com GPC/SEC (por exemplo, OMNISEC), sabe que toda análise depende da configuração do conjunto de colunas. E escolher a coluna certa para sua aplicação pode, às vezes, ser desafiador. Às vezes, pode ser necessário um conjunto de colunas completamente novo para diferentes tipos de amostras.

Há várias considerações a serem feitas ao selecionar o conjunto de colunas mais adequado para sua amostra. Você deve considerar o intervalo de tamanhos/pesos moleculares, a compatibilidade da fase móvel que você deve usar para dissolver a amostra e a coluna, a compatibilidade dos grupos funcionais na amostra e a fase estacionária da coluna. Se estiver usando várias colunas, certifique-se de que elas se complementam e a ordem em que devem ser conectadas.

Nesta postagem, forneceremos informações gerais sobre colunas e insights sobre como criar o conjunto de colunas ideal para sua amostra. As informações aqui são principalmente relacionadas à seleção do melhor conjunto de colunas do ponto de vista do alcance de tamanhos/pesos moleculares. Informações sobre colunas disponíveis para análises em diferentes fases móveis podem ser encontradas na postagem vinculada aqui e no webinar.

O que acontece em um conjunto de colunas?

Vamos começar com uma visão geral sobre como a separação dentro de um conjunto de colunas GPC/SEC funciona. Como pode ser visto na imagem acima, uma mistura dissolvida de duas amostras de tamanhos diferentes é introduzida na coluna. Com o passar do tempo, duas frações de amostras e o solvente de dissolução se movem através da coluna a velocidades diferentes. A amostra de maior tamanho é elucida primeiro (População 2), seguida pela amostra de menor tamanho (População 1) e, finalmente, o solvente de dissolução é eluído por último.

É importante entender que a separação se baseia no tamanho molecular, não na massa molecular da amostra!

Essa separação ocorre porque a fase estacionária da coluna é composta de partículas de gel poroso. Esses poros são grandes o suficiente para permitir que as moléculas da amostra se difundam dentro deles ao passar pela coluna. Moléculas pequenas difundem-se mais facilmente nos poros e, portanto, passam mais tempo neles do que moléculas de tamanho médio ou grande. As maiores são menos propensas a se difundir nos poros e, portanto, têm um percurso mais direto e rápido através da coluna.

Com o GPC/SEC, as separações são baseadas no tamanho molecular, com as moléculas maiores eluindo primeiro, seguidas das intermediárias e, por último, das menores. Por favor, veja a animação descrevendo este processo abaixo. O grande triângulo é elucido primeiro, sem gastar muito tempo se difundindo nos poros, seguido pelo quadrado intermediário e, por último, o pequeno círculo que pode facilmente mover-se através dos poros.

Camada mista e colunas de tamanho de poro único

As diferenças entre esses dois tipos de colunas são explicadas em detalhes nesta postagem. Em resumo, colunas de camada mista contêm um gel de fase estacionária com uma mistura de tamanhos de partículas e poros, proporcionando uma resolução abrangente sobre uma ampla gama de tamanhos/pesos moleculares. As colunas de tamanho de poro único contêm um gel de fase estacionária homogêneo, oferecendo excelente resolução sobre uma gama relativamente restrita de tamanhos/pesos moleculares.

Como combinar colunas para criar um conjunto de colunas

Para criar um conjunto de colunas otimizado para sua amostra, você precisará combinar duas ou mais colunas. (No entanto, se uma coluna oferece resolução suficiente para sua amostra e é tudo de que você precisa, combinar colunas pode não ser necessário.) Isso economizará tempo e fase móvel, o que muitas vezes é o caso com amostras de proteína. As proteínas abrangem uma ampla faixa de massas moleculares, mas devido à sua estrutura dobrada, a faixa de tamanhos das amostras de proteínas é mais estreita do que a faixa de tamanhos dos polímeros.

Existem três abordagens gerais adotadas ao combinar colunas para criar um conjunto. Sugerimos apenas essas, mas este não é um método definitivo.

2 colunas de camada mista: O conjunto de colunas mais universal e comum, abrangendo colunas para a fase orgânica, aquosa e específica. Para esclarecer, usaremos duas colunas de camada mista idênticas. Por exemplo, ao analisar um lote de polissacarídeos, muitas vezes usamos duas colunas A6000M, que são colunas de camada mista para análise de água. Usar duas colunas de camada mista assim tende a alcançar o ponto ótimo de maximizar a gama de tamanhos/pesos moleculares e manter o tempo de execução inferior a 45 minutos.

Combinação de colunas de MW alto/baixo e coluna de camada mista: Para amostras que contêm espécies com um tamanho/peso molecular particularmente alto ou baixo, como agregados ou oligômeros, preferimos adicionar uma coluna de tamanho de poro único de alto/baixo junto com uma única coluna de camada mista. Enquanto a coluna de tamanho de poro único de alto/baixo peso molecular garante resolução suficiente para características específicas da amostra em uma das extremidades do continuum de tamanhos moleculares, a coluna de camada mista explica o restante do material da amostra. Se você deseja melhorar a resolução entre o pico da amostra e do solvente, adicionar uma coluna de baixo peso molecular à coluna de camada mista encaixaria nesse propósito.

Combinação de várias colunas de tamanho de poro único: Esta estratégia é adequada quando você sabe que não precisa da resolução de faixa completa de tamanhos/pesos moleculares que a coluna de camada mista fornece. Esse tipo de conjunto de colunas pode ser benéfico em ambiente em que você está monitorando amostras semelhantes, como em QC. A vantagem é que você pode obter a maior resolução possível nos tamanhos/pesos moleculares relevantes para a amostra. Você pode combinar mais de duas colunas de tamanho de poro único para abranger uma ampla faixa de tamanhos/pesos moleculares, como T5000 + T3000 + T1000. Neste exemplo, o tempo de análise é prolongado, mas oferece uma melhor resolução.

Quando combinando colunas de tamanho de poro único, é importante garantir que as colunas não estejam mais de uma coluna separadas. Isso evitará diferenças de alcance de resolução. Revisando o exemplo acima com três colunas de tamanho de poro único, simplesmente combinar T5000 + T1000 não é recomendado. Pode resultar em perfis de eluição como o mostrado abaixo, gerando formas de pico e artefatos estranhos nos dados que não são da amostra, mas sim uma consequência da cromatografia.

A ordem das colunas

Muitas pessoas se perguntam “em que ordem devem ser conectadas as colunas quando as combinamos”.

Uma recomendação sensata que damos é começar com a maior coluna de tamanho/peso molecular e ir descendo para a coluna de menor tamanho/peso molecular. Isso proporciona que as maiores moléculas possam começar a se separar desde que a mistura da amostra inteira é introduzida pela primeira vez no conjunto de colunas. Caso as colunas estejam dispostas na ordem oposta, as moléculas maiores terão que ser forçadas através de colunas de tamanho/peso menor e podem potencialmente obstruir as de menor tamanho de se difundir nos poros.

Foi por isso que usamos os exemplos de T5000 + T3000 + T1000 acima. Ao combinar colunas de tamanho de poro único com uma de camada mista, adicione a coluna de tamanho de poro único de peso molecular grande antes da coluna de camada mista e, depois dela, uma coluna de tamanho de poro único de peso molecular baixo.