Boas Práticas para Calorimetria Exploratória Diferencial de Proteínas e Biopolímeros

por Verna Frasca, Tuesday, 14th August 2018

Em um blog anterior, discuti melhores práticas para obter dados de alta qualidade com um MicroCal DSC. Aqui estão mais práticas recomendadas para o sistema MicroCal PEAQ-DSC, bem como os sistemas MicroCal VP-Capillary DSC e VP-DSC. Essas melhores práticas se aplicam à análise de proteínas em solução e outros biopolímeros.

Requisitos de amostra:

Para obter dados de alta qualidade de Calorimetria Exploratória Diferencial (DSC), as amostras precisam estar no tampão desejado (pH, sal, excipientes, etc.), e o tampão correspondente deve ser usado na célula de referência do DSC e para as varreduras tampão-tampão.
Prepare as amostras no tampão desejado por diálise, uma coluna de dessalinização ou outro método de troca de tampão.
Guarde o tampão da diálise/troca de tampão para uso na célula de referência, nas varreduras tampão-tampão e na diluição das amostras.
Faixa de concentração de proteína recomendada de 0.1 mg/ml a 2 mg/ml.
T_ms de DSC podem ser dependentes da concentração.
- Para triagem de T_m e estudos de comparabilidade/seme-lhança, certifique-se de que todas as proteínas tenham a mesma concentração.

Configurações de DSC:

Ao usar DSC para triagem de T_m e estudos de comparabilidade/seme-lhança, certifique-se de que todas as configurações sejam idênticas, incluindo a taxa de varredura, a faixa de temperatura, o modo de feedback e o termostato de pré-varredura.
- T_ms e termogramas de DSC podem ser dependentes da taxa de varredura e do modo de feedback.
Faixa de temperatura: inicie a varredura 10-20°C abaixo do 1^º T_m e termine a varredura 10-20°C acima do T_m final.
Taxas de varredura:
- Taxa de varredura típica para proteínas e ácidos nucleicos é de 60 a 90 °C/h
- Taxa de varredura típica para lipídios é de 30 a 60 °C/h
- Para MicroCal PEAQ-DSC e VP-Capillary DSC, use uma taxa de varredura de 180 a 240 °C/h para aumentar a taxa de processamento de amostras durante a triagem de T_m
Modos de “Feedback” recomendados:
- proteínas – nenhum ou baixo
- DNA e RNA – baixo ou médio
- Lipídios – alto
“Termostato de pré-varredura” recomendado de 3 a 15 minutos.

Para sistemas automáticos MicroCal PEAQ-DSC e VP-Capillary DSC:

Certifique-se de que as amostras sejam armazenadas a uma temperatura adequada antes da análise DSC. Para proteínas e outras biomoléculas, configure a temperatura de resfriamento para 5 a 10°C. Se estiver estudando um material termostável, você pode ajustar o resfriamento para 25°C.
Utilize um mínimo de três recargas de purga (chamadas “número de ciclos de enchimento” no VP-Capillary DSC) para preencher as células DSC das placas de 96 poços.
Programe limpezas de células usando 20% de Contrad 70 ou 14% de Decon 90.

Qualidade dos dados brutos de DSC:

Sempre tenha uma varredura tampão-tampão correspondente (executada sob condições de varredura idênticas) para uso na análise de dados. Se desejar, você pode realizar uma varredura tampão-tampão antes de cada amostra.
Varreduras frequentes tampão-tampão servem como uma verificação adicional do desempenho do instrumento para garantir que as células do DSC estejam limpas e que o instrumento esteja funcionando.
As varreduras tampão-tampão devem ser reprodutíveis ao longo da sequência (assumindo os mesmos parâmetros de execução do DSC).
Com o PEAQ-DSC Automatizado, sua bomba de lavagem eficiente e protocolos otimizados de limpeza de célula DSC, é possível executar três (ou mais) amostras seguidas, sem realizar varreduras tampão-tampão entre elas.
O valor de DP (em mcal/min) para o termograma DSC bruto deve ser próximo de zero no início das varreduras tampão-tampão ou água-água.
No início das varreduras de proteínas, o valor DP geralmente se torna mais negativo, em comparação com as varreduras tampão-tampão correspondentes. Concentrações mais altas de proteínas têm uma deflexão negativa maior. Com um bom ajuste de tampão, essa diferença de DP deve ser aproximadamente de 0,15 a 0,25 mcal/min para cada 1 g/L de proteína (Figura 1).
Se a diferença de DP entre as varreduras de proteína e tampão-tampão for maior que 1 mcal/min, isso pode ser devido a um desajuste de tampão entre proteína e tampão, uma célula suja, uma célula sub-preenchida, bolhas na célula ou proteína mais concentrada (Figura 2).