Práticas recomendadas para Calorimetria de Titulação Isotérmica para estudar interações de ligação – Parte 2

Aqui está o segundo blog de práticas recomendadas para realizar experimentos de ligação tradicionais com os sistemas MicroCal PEAQ-ITC, VP-ITC e ITC200. 

Aqui está o primeiro: Práticas recomendadas para ITC para estudar interações de ligação – Parte 1

Preparando o ITC:

• Realize uma inspeção visual do sistema ITC e verifique conexões de cabos soltas, seringa de injeção danificada, conexões de tubos com vazamentos, descoloração ao redor da célula, etc.
• Certifique-se de que haja água na célula de referência do ITC e substitua a água regularmente durante o uso do ITC (uma vez por semana é recomendada)
• Certifique-se de que o ITC e o controlador estejam ligados, o software de controle esteja aberto, o instrumento esteja online e o termostato do instrumento esteja configurado para a temperatura experimental.
  • Os ITCs MicroCal podem ser mantidos ligados indefinidamente e termostatizados a 25 °C
• Limpe a célula e a seringa do ITC, utilizando o protocolo de limpeza e reagentes recomendados
  • Recomenda-se enxaguar a célula do ITC com 20% de Contrad 70/14% Decon 90, seguido de água, após cada experimento ITC.
  • Realize “imersões” regulares com 20% de Contrad 70/14% Decon 90 na célula do ITC, aquecida a 60 °C, por pelo menos 30 minutos. Resfrie a célula e enxágue com água. Se você estiver trabalhando com uma proteína pegajosa ou outra biomolécula, pode ser necessário realizar imersões com detergente com mais frequência.
  • Certifique-se de que a seringa do ITC seja enxaguada com metanol e seca antes de adicionar o ligante.
  • Você também pode enxaguar a seringa do ITC com vários volumes de solução de ligante.
• Preencha a célula e a seringa do ITC, utilizando os protocolos recomendados de preenchimento e carregamento. Não é necessário desgaseificar as amostras ao usar o PEAQ-ITC e o ITC200
  • Enxágue a célula do ITC com buffer de amostra antes de preenchê-la com a amostra.

Configurações do ITC:

• Ao usar dados de ITC para triagem e comparação de afinidade e parâmetros termodinâmicos, certifique-se de que todas as configurações do projeto experimental sejam iguais, incluindo temperatura, modo de feedback e condições de injeção.
• Consulte a Tabela 1 para as configurações recomendadas.

Para sistemas automatizados MicroCal PEAQ-ITC e Auto iTC200:

• Certifique-se de que as amostras estejam armazenadas a uma temperatura apropriada antes da análise ITC. Para proteínas e outras biomoléculas, configure a temperatura da bandeja de armazenamento de placas entre 5 e 10 °C. Se você estiver estudando um material termostável, pode configurar a bandeja para 25 °C.
• Programe limpezas da célula e da seringa usando 20% de Contrad 70 ou 14% de Decon 90, usando rotinas de automação apropriadas e durante a manutenção regular.

Mais práticas recomendadas estarão em blogs futuros.

Conteúdo relevante:

• Calorimetria de Titulação Isotérmica: Teoria e Prática
• Dicas práticas para experimentos MicroCal PEAQ-ITC
• Abordando a complexidade das interações de ligação com ITC – Tire o máximo de seus dados ITC
• Biomoléculas: qualidade da amostra e dos dados na análise de interação – Dois lados da mesma moeda
• Não jogue fora seus dados de valor N “ruins” de ITC
• Padrão ouro para afinidade de ligação

Postagens anteriores:

• Práticas recomendadas para ITC para estudar interações de ligação – Parte 1
• Práticas recomendadas para ITC para estudar interações de ligação – Parte 3
• Práticas recomendadas para Calorimetria de Titulação Isotérmica para estudar interações de ligação – Parte 4
• Calorimetria de Titulação Isotérmica – Uma ferramenta quente de caracterização para interações biomoleculares
• Calorimetria de Titulação Isotérmica: Uma ferramenta essencial para medições de afinidade de ligação em pesquisas das ciências da vida
• O que há de novo em ITC? Edição de junho de 2018