Melhores Práticas para Calorimetria de Titulação Isotérmica para estudar interações de ligação – Parte 4

por Verna Frasca, Thursday, 18th April 2019

Aqui estão várias melhores práticas para realizar experimentos tradicionais de ligação com os sistemas MicroCal PEAQ-ITC, VP-ITC e iTC200. Esta é uma continuação de blogs anteriores ‘Melhores Práticas para Calorimetria de Titulação Isotérmica para estudar interações de ligação’ parte 1, parte 2 e parte 3.

Problemas comuns com dados brutos de ITC e possíveis causas

  • Calores de injeção grandes, devido a grandes calores de diluição:

    • Isso ocorre tipicamente devido a uma incompatibilidade entre as soluções de macromoléculas e ligantes, que é muito maior do que o calor de ligação real.
    • A isoterma de ligação muitas vezes se parece com uma linha reta, sem evidência de saturação de ligação.
    • Normalmente, essa grande mudança de calor não pode ser corrigida pela subtração de uma titulação de controle.

  • DP não retorna ao baseline pré-injeção antes da próxima injeção.

    • Isso pode ser devido ao tempo insuficiente entre as injeções para permitir a medição completa do calor de ligação.
    • Nem toda a mudança de calor é medida por injeção, afetando a qualidade dos dados. Ajuste o volume de injeção, reduza a concentração de ligante e/ou aumente o tempo entre as injeções.
    • Se você notar esse efeito durante o experimento, pode aumentar o intervalo entre as injeções restantes.
    • Também pode haver outro processo (mais lento) causando uma mudança de calor, como mudanças conformacionais.

  • Picos nas injeções, alguns picos são muito maiores (ou muito menores) do que outros:

    • Causado por bolhas na célula ITC e/ou seringa, ou por uma ponta de êmbolo suja ou danificada no injetor ITC.

  • Baseline ruidoso e/ou picos entre injeções:

    • Bolhas de ar devido a um enchimento inadequado da célula e/ou seringa, células e/ou seringa sujas.
    • Também pode ser devido a uma agulha de injeção dobrada ou um problema no sistema de injeção.

  • Baseline de degrau: há uma mudança na capacidade de calor do sistema, devido à hidrólise enzimática, pH ou incompatibilidade de tampão:

    • Se estiver estudando a ligação entre substrato e enzima, use um substrato não hidrolisável.
    • O baseline de degrau também pode ser devido a bolhas na célula ITC ou seringa, devido a um enchimento insuficiente.

  • Calor de ligação não detectável:

    • Não há ligação.
    • É possível que a ligação esteja ocorrendo e a mudança de calor seja muito baixa. A entalpia de ligação pode ser menor do que o esperado e/ou a afinidade de ligação é mais fraca do que o esperado.
    • Para aumentar a mudança de calor/injeção, você precisa aumentar a concentração de macromolécula e/ou ligante; aumentar o volume de injeção e/ou alterar a condição experimental, como temperatura experimental ou tampão/pH.

Corrigindo o calor de diluição, antes da análise dos dados

  • Como discutido em blogs anteriores, a correspondência próxima das soluções de macromolécula e ligante é essencial para evitar grandes calores de diluição que podem mascarar o sinal de ligação real. Esses calores não relacionados com a ligação precisam ser subtraídos de cada um dos pontos na isoterma de ligação titulação macromolécula-ligante antes de mais análises de dados. Isso pode ser realizado de várias maneiras:
  • Uma estimativa do calor de diluição pode ser obtida diretamente da titulação experimental ao se calcular a média dos calores integrados associados com as últimas injeções. Essa subtração pode ser feita usando a opção “Matemática Simples” na análise de dados do Origin. Este método assume que os sites de ligação foram totalmente saturados com ligante ao final do experimento ITC.
  • Para PEAQ-ITC, também é possível usar a opção “compensação ajustada” durante a análise de dados para corrigir o calor de diluição.
    • Se você tiver uma titulação de controle de solução de ligante em tampão, poderá realizar uma subtração ponto a ponto dos valores de pico integrados deste controle daqueles no experimento. Para calores de ligação pequenos, essa correção poderia resultar em uma isoterma de ligação mais ruidosa, em comparação com a subtração de uma constante.
  • Note que a titulação de controle deve resultar em calores de injeção reprodutíveis ao longo da titulação e resultar em um gráfico linear sem ou com uma inclinação suave (Figura 1).
  • Em vez de uma correção ponto a ponto, você pode criar uma linha ou obter uma mudança média de calor de injeção para a titulação de controle e subtrair isso dos dados experimentais.
  • Se as últimas injeções da curva de ligação experimental tiverem uma inclinação não nula, e/ou a titulação de controle for não linear ou tiver uma inclinação grande, você deve considerar as possíveis razões para tais resultados e se isso pode ser corrigido adequadamente.
  • Depois que os calores de diluição forem contabilizados por uma dessas abordagens, a entalpia de ligação na saturação deve se aproximar de zero e a isoterma de ligação pode ser ajustada usando um modelo apropriado para determinar os parâmetros de ligação.

Figura 1: Dados brutos de ITC, com a titulação de controle (ligante em tampão) (vermelho) e o experimento de ligação (ligante em macromolécula) (preto). Note que os picos para a titulação de controle são similares em forma e tamanho às injeções finais do experimento de ligação.

Figura 1: Mudanças de calor normalizadas, com a titulação de controle (vermelho) e o experimento de ligação (preto). Os dados são ajustados ao modelo de ligação de um conjunto de sites.

Otimização dos experimentos de ITC, após os primeiros experimentos

  • É possível alterar e mudar a forma da isoterma de ligação ajustando a concentração da amostra na célula e/ou da amostra na seringa para otimizar a qualidade dos dados obtidos. Você também pode alterar o volume de injeção e o número de injeções. Se você tiver dados preliminares, pode usar o assistente de “Projetar Experimento” opções avançadas, ou outra ferramenta de simulação de dados ITC, para simular isotermas de ligação e projetar futuros experimentos.
  • Você pode não conseguir usar a(s) concentração(ões) “ótimas” para sua ligação: concentrações de reagentes muito baixas podem resultar em um sinal experimental muito pequeno (que depende de ΔH de ligação), enquanto concentrações muito altas podem simplesmente ser impraticáveis ou impossíveis de alcançar para biopolímeros (por exemplo, se uma proteína tende a agregar em alta concentração).
  • Se você não puder obter uma concentração de ligante alta o suficiente para alcançar a saturação de ligação após a injeção do conteúdo do volume da seringa, poderá manter o complexo macromolécula-ligante na célula ITC, encher a seringa com mais ligante e realizar um segundo experimento de titulação. Isso pode ser repetido até que a saturação de ligação seja alcançada.
  • O que acontece se a afinidade de ligação e a concentração da macromolécula resultarem em um valor de C fora do intervalo ideal? Para reações de ligação muito apertadas (onde condições de C> 1000 são prováveis) apenas ΔH e N podem ser determinados diretamente com precisão de um experimento ITC. Abordagens adicionais, como usar um experimento de deslocamento/competição com um ligante pré-ligado de ligação fraca, podem ainda permitir ao usuário determinar um KD.
  • Para eventos de ligação fraca, ainda pode ser possível obter dados úteis trabalhando no “baixo intervalo de C” (valores de C abaixo de 1-5) usando uma concentração muito alta de ligante para direcionar a ligação para perto da saturação no final da titulação. Nesse cenário, as isotermas de ligação tendem a ser não-sigmoides e podem precisar de fixação de N durante o ajuste, então apenas a afinidade de ligação pode ser medida com confiança. ΔH não será bem definido pelo experimento. No entanto, em casos onde N é conhecido com confiança e pode ser fixado no procedimento de ajuste, se necessário, tais experimentos ainda podem ser muito informativos. Você também pode fazer um experimento de deslocamento/competição projetado para caracterizar ligantes fracos.

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