Reduza o risco da estabilidade antes que ela se torne um problema
Um candidato que passa na triagem de ligação não é necessariamente um candidato que sobreviverá ao desenvolvimento.
Agregação, instabilidade coloidal e sensibilidade térmica estão entre as razões mais comuns para que biológicos falhem nas etapas subsequentes – e muitas vezes passam despercebidas porque as medições capazes de detectá-las são aplicadas tarde demais.
A janela entre a confirmação do hit e a nomeação do lead é onde o risco de estabilidade é mais controlável. Nesta fase, os volumes de amostra são pequenos, o pool de candidatos ainda é amplo o suficiente para permitir seleções significativas, e o custo de eliminar uma molécula problemática é uma fração do que será alguns meses depois no programa. À medida que um programa de biológicos faz a transição da descoberta e do desenvolvimento inicial para a fase pré-clínica, a validação de hits dá lugar à otimização de leads e candidatos, com uma exigência crescente por uma caracterização biofísica mais profunda e extensiva. É nesse ponto que a triagem de estabilidade passa de função de apoio para uma função central.
Neste blog, focamos no poder do espalhamento dinâmico de luz (DLS) e do espalhamento estático de luz (SLS) como base da triagem de estabilidade inicial, e em como eles atuam em conjunto com a análise de rastreamento de nanopartículas (NTA) e a calorimetria diferencial de varredura (DSC) para construir uma visão completa da desenvolvibilidade do candidato.
Por que o risco de estabilidade é um problema oculto
Uma molécula que se liga ao seu alvo com alta afinidade ainda pode agregar sob condições de formulação, desnaturar durante o armazenamento ou se comportar de forma imprevisível nas concentrações necessárias para administração subcutânea.
No entanto, o potencial de surgimento desses problemas é amplamente invisível para os ensaios de ligação e atividade que dominam a triagem inicial. Um ensaio de ligação de alto rendimento pode lhe dizer que uma molécula interage com seu alvo, mas não diz nada sobre se essa molécula permanecerá monodispersa em altas concentrações, sobreviverá a três ciclos de congelamento/descongelamento ou manterá sua estrutura de ordem superior em toda a faixa de pH de um tampão de formulação típico.
A triagem biofísica inicial de estabilidade foi projetada para fechar essa lacuna, adicionando as leituras ortogonais que os dados de ligação não podem fornecer.
O que DLS e SLS revelam – e por que isso importa no início
O espalhamento dinâmico de luz na linha Zetasizer Advance mede o raio hidrodinâmico de proteínas em solução explorando a relação entre o tamanho da partícula e a taxa de difusão. Para candidatos biofarmacêuticos, é uma das medições iniciais mais ricas em informação disponíveis. Também é rápida de executar, requer amostra mínima e é sensível a mudanças diagnosticamente significativas muito antes de se tornarem visíveis por outros meios.
O primeiro sinal de formação de agregados
A dependência da intensidade do espalhamento de luz com a sexta potência do tamanho da partícula torna o DLS desproporcionalmente sensível a espécies maiores. Um único agregado em uma população predominantemente monomérica gera um sinal de espalhamento muito acima de sua contribuição de volume. Isso significa que o DLS pode sinalizar os primeiros indícios de formação de agregados em um ponto em que isso seria totalmente invisível em uma distribuição ponderada por volume ou por número. Monitorar tamanho e polidispersidade ao longo de uma rampa de temperatura fornece a temperatura de agregação (Tagg), que é um ponto mensurável precoce em que uma formulação começa a falhar sob estresse térmico.
Previsão do comportamento em concentrações de formulação
Tagg informa quando uma proteína agrega sob estresse térmico, mas não por quê, nem como o candidato se comportará nas altas concentrações exigidas para formulação. Para isso, dois parâmetros de interação derivados do mesmo fluxo de trabalho de medição por DLS e SLS fornecem a resposta preditiva prospectiva.
O parâmetro de interação por difusão kD, derivado de medições de DLS ao longo de uma série de concentrações, quantifica o efeito líquido das interações proteína-proteína em solução. Um kD positivo elevado indica interações repulsivas: um candidato que resiste à autoassociação e provavelmente permanecerá estável nas concentrações de formulação. Um kD negativo sinaliza interações atrativas, prevendo maior propensão à agregação e viscosidade elevada sob condições de formulação.
O segundo coeficiente virial B22, derivado de medições de SLS, fornece o componente termodinâmico da mesma análise. Valores positivos de B22 indicam que a proteína prefere associação com o solvente em vez de autoassociação, tornando-se um indicador favorável de solubilidade e estabilidade coloidal. Valores negativos de B22 sinalizam candidatos em risco de agregação ou precipitação.
De forma crítica, ambos os parâmetros são derivados dos mesmos experimentos em série de concentração, assim como kD está relacionado a B22. Medir B22 diretamente é preferível, porque é a medida termodinâmica, dependente da concentração, da atração/repulsão líquida entre proteínas e, portanto, mais diretamente interpretável para o risco de agregação, enquanto kD é um proxy indireto baseado em difusão que pode ser distorcido por muitos fatores, como tamanho molecular, fricção e viscosidade.
Isso significa que kD, B22, Tagg, PDI e a distribuição de tamanho de partículas podem ser obtidos de um único instrumento Zetasizer Advance em um fluxo de medição coordenado. Este é o valor prático da triagem inicial por DLS e SLS: identificar as condições sob as quais a agregação tem maior probabilidade de ocorrer, antes que recursos significativos tenham sido comprometidos com uma formulação.
Resolvendo populações complexas com NTA
O DLS mede uma média de conjunto da população total. Em amostras heterogêneas, nas quais as espécies agregadas abrangem uma ampla faixa de tamanhos, a análise de rastreamento de nanopartículas (NTA) na NanoSight Pro fornece dados de tamanho e concentração partícula a partícula que o DLS de conjunto não consegue resolver.
As duas técnicas são complementares: DLS para velocidade, sensibilidade e extração de parâmetros coloidais; NTA para resolver e quantificar as populações agregadas maiores que exigem uma visão de maior resolução.
O que a DSC acrescenta à análise
A DSC complementa DLS e SLS ao caracterizar a estabilidade estrutural, determinando como a arquitetura dobrada da proteína responde ao estresse térmico.
O MicroCal PEAQ-DSC mede o calor absorvido por uma proteína à medida que ela se desenrola com o aumento da temperatura. A temperatura de fusão (Tm) é a temperatura na qual 50 % da população proteica já se desenrolou. Tm mais alto geralmente se correlaciona com melhor estabilidade real em condições de armazenamento, e um Tm mais baixo é um indicador inicial bem estabelecido de risco de formulação.
Os dados combinados de DSC e DLS fornecem a capacidade de distinguir entre dois modos de falha mecanisticamente distintos: agregação acoplada ao desenovelamento e agregação que ocorre em temperaturas abaixo da desnaturação como um evento puramente coloidal.
Esses dois cenários têm implicações diferentes para a estratégia de formulação e impactos muito distintos no desenvolvimento subsequente. Identificar cedo qual modo se aplica a um determinado candidato pode evitar que uma equipe de formulação passe meses otimizando condições para uma molécula com uma limitação intrínseca que não pode ser totalmente resolvida.
Da triagem à desenvolvibilidade
Usados em conjunto e aplicados desde cedo, a combinação de DLS, SLS, NTA e DSC oferece às equipes de desenvolvimento os dados necessários para tomar melhores decisões sobre candidatos no momento em que a falha ainda pode ser evitada.
Um candidato que apresenta excelente afinidade, mas alto PDI, kD negativo e um Tm significativamente abaixo da média do setor revelou algo importante: ele representa um risco de desenvolvibilidade. Detectar isso durante a avaliação de lead candidates é fundamentalmente diferente de detectá-lo durante o desenvolvimento da formulação, quando um candidato preferencial já foi nomeado.
Olhando para frente, o surgimento de plataformas de alto rendimento capazes de realizar DLS, SLS e medições de estabilidade estrutural baseadas em fluorescência intrínseca pode estender essa capacidade de triagem inicial para uma escala antes impraticável com instrumentos individuais. Isso levaria a profundidade de caracterização descrita aqui para as etapas mais iniciais do funil de candidatos.
Saiba mais sobre o fluxo completo de caracterização de biológicos da Malvern Panalytical.
Em breve! Acelere a caracterização de biológicos com uma nova plataforma inovadora
Dados de estabilidade só são valiosos quando você consegue gerá-los com rapidez, confiança e em escala. É por isso que, em setembro, vamos apresentar uma nova plataforma analítica inovadora, projetada para eliminar o trade-off tradicional entre velocidade e profundidade de dados na caracterização de biológicos.
Veja a nova plataforma em ação
Participe do nosso próximo webinar, Ready to Accelerate Your Biologics Pipeline? Stop Compromising in Biologics Characterization, no qual revelaremos essa plataforma inovadora e demonstraremos como ela pode ajudar a tomar decisões de desenvolvimento mais rápidas e mais seguras.
Inscreva-se agora para garantir sua vaga:
{{ product.product_name }}
{{ product.product_strapline }}
{{ product.product_lede }}
