N-valor dados ITC

Não descarte seus dados “ruins” de N-valor ITC

O N-valor, comumente referido como a estequiometria, é frequentemente usado como um indicador de uma titulação “boa” ou “ruim”. O raciocínio é o seguinte – “se meu N-valor é 20% ou mais diferente da estequiometria esperada (frequentemente 1), então meus resultados de titulação são inválidos”. Na realidade, isso nem sempre é o caso. É importante entender que o N-valor ITC não é a mesma coisa que a estequiometria (razão de ligação). O N-valor de fato é igual à estequiometria se as concentrações que usamos para o ajuste forem corretas e 100% ativas. Uma maneira de expressar o N-valor é a seguinte:

Qualquer um dos três valores nesta equação pode alterar N, o que significa que N é uma medida tanto da razão de ligação quanto da atividade das amostras. Dois desses valores precisam ser conhecidos (ou assumidos) para obter o terceiro. Por exemplo, se alguém está interessado na estequiometria, então as concentrações fornecidas no ajuste devem ser precisas e 100% ativas. Se alguém está interessado na atividade da amostra na célula (frequentemente proteína), então a estequiometria e a concentração ativa da amostra na seringa (ligante) devem ser assumidas.

Considere a FIG.1:

As concentrações fornecidas são 20uM de proteína (na célula) e 200uM de ligante (na seringa), N=0.86. Provavelmente uma dessas duas (ou ambas) concentrações não está correta, a provável razão de ligação é ou 1:1 (N=1) ou 1:2 (N=0.5, 2 proteínas: 1 ligante). Se assumirmos que é 1:1 e que os 200uM de ligante estão corretos, então reajustar os dados com 17uM de proteína trará o N para 1, significando que a concentração efetivamente competente de ligação da proteína é 17uM. No novo software de Análise de Dados PEAQ, qualquer uma das 3 incógnitas (N, [proteína],[ligante]) pode ser atribuída como variável.

O N-valor pode ser facilmente visualizado como o valor do eixo X no ponto médio (infleção) de uma curva sigmoidal ITC. Há certas titulações que não têm um ponto de infleção claro – elas são ou com 1) baixo valor C (curva plana) ou 2) atingem saturação “muito cedo”, seja porque a concentração ativa na célula é muito baixa ou a concentração de ligante é muito alta.

1)       No caso de baixo valor C, o problema é afinidade fraca e baixas concentrações resultando em curva plana. Considere a FIG.2:

Kd está na faixa média a alta de uM, mas a concentração de proteína é apenas 50uM, isso resulta em curva plana. Para transformá-la em sigmoide com ponto médio bem definido, precisamos ter concentrações de proteína de 10x (ou mais) acima do Kd. Muitas vezes isso não é uma opção, então os pesquisadores recorrem à chamada titulação de baixo valor C – neste caso a concentração de proteína é mantida baixa, mas a concentração de ligante é aumentada para que a curva atinja algum grau de saturação (note a alta razão molar). Tal curva carece de ponto de infleção, então o valor de N é desconhecido e deve ser assumido e fixado em um valor constante durante o ajuste.

2)       No caso de “saturação precoce” – o problema são concentrações imprecisas. O valor de N aparece muito pequeno. Por exemplo, na FIG.3:

Se deixarmos o N variar durante o ajuste, obteremos um valor de 0.0008, o que certamente não é a estequiometria real, além disso, o dH é incomumente alto (dH para interações biológicas raramente excede 30 kcal/mol).

Como extrair dados confiáveis de Kd e dH de tais titulações? Realizando ajustes com alguns valores extremos presumidos de N e registrando a variação de Kd e dH. Por exemplo, podemos supor que a estequiometria para a FIG.2 está entre 0.1 e 5, com base na qualidade razoável dos ajustes que obtemos com esses 2 cenários limite. Neste caso, o Kd varia muito pouco – de 980uM para 588uM, respectivamente. Da mesma forma para a FIG.3, o Kd varia de 25uM para 37uM para N de 0.2 a próximo de 0.

Embora curvas não sigmoides sejam mais desafiadoras de se analisar, elas não devem ser descartadas como resultados inadequados. Os valores de Kd podem não ser conhecidos com absoluta certeza, mas geralmente convergem para valores em um intervalo relativamente estreito, mesmo quando há grande incerteza no N-valor (e por extensão nas concentrações ativas).

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