Pontos para Medição de DSC (Calorimetria de Varredura Diferencial) de Proteínas e Biopolímeros

MicroCal PEAQ-DSC (calorímetro de varredura diferencial) para avaliação de estabilidade de biomoléculas, aqui estão os pontos a serem observados na medição de DSC (calorimetria de varredura diferencial) de proteínas e biopolímeros.

Para obter dados DSC de alta qualidade, em que devemos prestar atenção? E o estado da amostra? Quais são as condições de medição? Vamos revisar com a lista a seguir!

【Condições da Amostra】

Para obter dados DSC de alta qualidade, siga os itens abaixo.

• Certifique-se de que a composição do tampão seja a mesma tanto na célula de amostra como na célula de referência.
• Prepare a amostra para que a troca do tampão ocorra, usando diálise, coluna de dessalinização ou outros métodos.
• Guarde o diafiltrado e o tampão utilizados na troca para usar na célula de referência e escaneamento de tampão-tampão (a seguir, escaneamento de tampão).
• A concentração recomendada de amostra de proteína é de 0.1 a 2 mg/mL.
• T_m (temperatura de desnaturalização) obtido por DSC depende da concentração. Portanto, ao realizar a triagem de T_m ou avaliações de equivalência, as concentrações de todas as amostras devem ser iguais.

【Configuração de Condições de Medição】

• Para realizar triagem de T_m ou avaliações de equivalência por DSC, todas as condições de medição (taxa de varredura, faixa de temperatura, modo de feedback, termostato pré-varredura, etc.) devem estar alinhadas. A forma do termograma é influenciada pela taxa de varredura e pelo modo de feedback.
• Faixa de temperatura: ajuste a temperatura de início da medição para 10-20°C abaixo do primeiro valor de T_m e a temperatura de fim para 10-20°C acima do último valor de T_m.
• Taxa de Varredura (valores recomendados geralmente)
  • Proteínas, ácidos nucleicos: 60-90°C/h
  • Lipídios: 30-90°C/h
  Para aumentar o rendimento na triagem de T_m, utilize 180-240°C/h (equipamento compatível: PEAQ-DSC, VP-Capillary DSC).
• Modo de Feedback
  • Proteínas: nenhum ou baixo
  • Ácidos nucleicos: baixo ou médio
  • Lipídios: alto
• Termostato pré-varredura: recomendam-se 3-15 minutos.

【Notas sobre o Sistema com Amostrador Automático】

• Considere a estabilidade da amostra e armazene-a na temperatura adequada. Se a amostra for proteína ou outro biopolímero, ajuste a temperatura do cooling stack para 5-10°C. Se for estável, 25°C é aceitável.
• Purgas/Reabastecimentos (ou número de cursos de enchimento) devem ser configurados para, no mínimo, 3 vezes.
• Inclua limpeza com detergente com 14% Decon90 (ou 20% Contrad70) no método.

【Qualidade dos Dados Brutos de Medição】

• A medição da varredura de amostra e do tampão deve ser feita sempre sob as mesmas condições. Se necessário, a varredura de tampão pode ser realizada antes de cada amostra.
• A execução frequente da varredura de tampão permite avaliar se a célula está limpa e se o equipamento está funcionando adequadamente.
• Se um cronograma de medição com as mesmas condições for configurado, a reprodutibilidade da varredura de tampão deve ser alta. (No PEAQ-DSC Automated, há uma bomba de limpeza com alta eficiência e um protocolo de limpeza otimizado. É possível medir continuamente 3 amostras (ou mais) sem intercalação de varredura de tampão entre as medições.)
• O valor DP (mcal/min) no início da medição da varredura de tampão e água-água deve ser quase zero.
• O valor DP na medição da amostra de proteína tende a ser negativo em comparação à varredura de tampão. Se a proteína estiver em alta concentração, o valor negativo será maior. Com pequena discrepância na composição do tampão, a diferença entre a varredura de amostra e tampão fica entre 0.15-0.25 mcal/min por 1 g/L de concentração de proteína. (Figura 1)

Se a diferença de DP entre a varredura de amostra e tampão for de 1 mcal/min ou mais, as seguintes causas podem ser consideradas. (Figura 2)

• Desajuste entre a amostra e o tampão
• Células sujas
• Enchimento inadequado da solução
• Incorporação de bolhas de ar
• Amostra altamente concentrada