DSC e estabilidade de proteínas: O que significa a mudança de entalpia?

por Stoyan Milev, Tuesday, 25th August 2020

A Calorimetria de Varredura Diferencial (DSC) é o único método analítico que mede diretamente a mudança de entalpia (∆H) de uma transição térmica, como a desnaturação térmica de uma proteína, ácido nucleico ou outro biopolímero.

O que é ∆H?

∆H é a energia total absorvida para elevar o sistema à temperatura T a pressão constante. Para uma proteína, isso significa a energia (calor) gasta para desenrolá-la, e o ∆H é positivo, representando um processo endotérmico. Esta energia está associada a todos os movimentos atômicos e moleculares, bem como à energia das ligações que mantêm a proteína na conformação dobrada. 

∆H é calculado integrando a área sob o termograma (veja figura abaixo), e é representado em calorias (ou joules) por mol de proteína. À medida que a proteína é exposta a temperaturas crescentes durante um experimento de DSC, ela começa a desnaturar termicamente, à medida que as ligações não covalentes são quebradas. O ∆H está relacionado ao número de ligações necessárias para manter a proteína em sua conformação nativa (dobrada).

∆H depende de quão precisamente medimos a concentração total de proteína. Se a concentração protéica não for determinada com precisão, o valor calculado de ∆H será impactado.

O que o valor de ∆H nos diz na prática?

Ao comparar os resultados do DSC de diferentes proteínas, a proteína com o maior valor de ∆H não é necessariamente mais estável do que aquela com um ∆H menor. Como ∆H é normalizado pela concentração molar total de proteína, o valor geralmente será proporcional ao tamanho da proteína. A maioria das proteínas tem a mesma densidade de ligações (ligações por volume). É razoável esperar que uma proteína com um peso molecular maior também possua um ∆H maior.

∆H depende da porcentagem de proteína nativa em solução

Uma consideração importante é que o DSC apenas mede o valor de ∆H para a proteína que está inicialmente na sua conformação dobrada (nativa). A magnitude de ∆H depende da concentração da fração dobrada. Se a fração inicial de proteína dobrada for menor que 100% da concentração total de proteína, o valor de ∆H calculado será correspondentemente menor.

A figura abaixo mostra termogramas de DSC para a mesma proteína, medidos em diferentes momentos durante o armazenamento. O termograma azul é para a proteína recém-preparada, que é 100% proteína nativa (dobrada). À medida que a amostra de proteína se deteriora durante o armazenamento, a fração de proteína nativa na solução começa a diminuir, resultando em uma diminuição da entalpia nos termogramas de DSC. Podemos usar os valores relativos de ∆H dos diferentes termogramas para estimar a fração de proteína dobrada de cada amostra, quando temos um termograma de DSC de referência com 100% de proteína nativa.

Neste exemplo, o ∆H para a amostra com o termograma verde tem 50% do ∆H da amostra azul, sendo assim 50% proteína dobrada. A amostra laranja tem 25% de proteína dobrada, e a amostra vermelha tem 10% de proteína dobrada, em relação ao termograma azul.

Termogramas de DSC de proteína com diferentes frações de proteína dobrada. Os valores de ∆H (das áreas integradas sob as curvas) para cada termograma são: azul – 100 kcal/mol; verde – 50 kcal/mol; laranja – 25 kcal/mol; vermelho – 10 kcal/mol.

Entalpias calorimétrica e de van’t Hoff

Até agora neste blog, escrevemos sobre a entalpia “calorimétrica” medida diretamente pelo DSC e frequentemente representada como ∆Hcal. Existe outro tipo de entalpia que podemos calcular a partir dos dados de DSC, a entalpia de van’t Hoff –  ∆HvH.  Este valor está disponível a partir do ajuste do modelo DSC não-biestável. ∆HvH é também a entalpia determinada a partir de qualquer técnica de fusão térmica não calorimétrica (indireta), como dicroísmo circular.

Com DSC, ∆Hcal é determinado apenas pela área sob um pico de transição, enquanto ∆HvH é determinado apenas pela forma do pico de transição. Quanto mais acentuada a transição, maior é ∆HvH, e vice-versa. ∆Hcal é dependente da concentração, mas HvH não é. 

Geralmente, uma razão ∆Hcal /∆HvH igual a 1 é tomada como uma indicação de que a transição em estudo se conforma ao mecanismo de desenrolamento biestável. Uma razão ∆Hcal /∆HvH maior que um é uma indicação da presença de intermediários significativamente populados; e uma razão ∆Hcal /∆HvH menor que um é uma indicação de interações intermoleculares.

Usando o ∆Hcal /∆HvH, podemos estimar que uma grande fração da proteína está inativa. Se tivermos uma proteína de domínio único simples e assumirmos que não há intermediários, pode-se esperar que seu desenrolamento tenha uma razão de ∆Hcal /∆HvH  não muito distante de 1. Assim, um  ∆Hcal significativamente menor que o ∆HvH , pode indicar que uma grande fração da proteína já está inativa. 

Resumindo, a análise de ∆H por DSC pode fornecer insights sobre o mecanismo de desenrolamento de proteínas e quanto da proteína está em sua conformação nativa.

Leitura adicional

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