Espalhamento Dinâmico de Luz – Termos Técnicos Específicos

1. Tamanho Médio Z (Z-Average size)

      O tamanho médio Z ou mediana Z usada no Espalhamento Dinâmico de Luz (DLS) é também conhecida como mediana cumulativa. Este é o parâmetro mais importante e estável gerado por essa técnica. A mediana Z é regulamentada pelas normas ISO 13321 e mais recentemente ISO 22412, sendo o melhor valor a ser reportado durante a aplicação em controle de qualidade, e a norma ISO define esta mediana como o ‘diâmetro médio harmônico intensivo’.

  O tamanho médio Z pode ser comparado com tamanhos medidos por outras técnicas se a amostra for unimodal (ou seja, apenas um pico) e esférica ou quase esférica em forma, uniformemente distribuída (ou seja, distribuição muito estreita) e dispersa em um dispersante adequado, pois o valor da mediana Z pode ser sensível a pequenas alterações na amostra, como a presença de pequenas agregações. O Z-médio é um parâmetro hidrodinâmico e deve-se observar que ele aplica-se apenas a partículas dispersas ou moléculas em solução. 

2. Análise de Cumulantes

     Este é um método simples para analisar a função de autocorrelação gerada por experimentos de DLS. O cálculo é regulamentado pelas normas ISO 13321 e ISO 22412. Sendo uma expansão em momentos, pode gerar muitos valores, mas somente os dois primeiros termos são realmente utilizados.

  Ou seja, os termos são conhecidos como o valor médio (Z-médio) e um parâmetro de largura conhecido como Indice de Polidispersidade (PdI). O Z-médio é calculado com base na intensidade e não deve ser confundido ou comparado diretamente com valores médios de massa ou número gerados por outras técnicas. O cálculo é regulamentado pelas normas ISO. Portanto, qualquer sistema que implemente tal cálculo conforme recomendado deve apresentar resultados comparáveis se o mesmo ângulo de dispersão for utilizado.

3. Índice de Polidispersidade (Polydispersity Index)

     Este índice é um número derivado de um ajuste simples de dois parâmetros aos dados de correlação (análise de cumulantes). O índice de polidispersidade é adimensional e ajustado de modo que valores inferiores a 0,05 raramente ocorram, exceto para padrões de referência altamente monodispersos. Valores superiores a 0,7 indicam que a distribuição da amostra é muito ampla e pode não ser adequada para a técnica de Espalhamento Dinâmico de Luz (DLS).

  Algoritmos de distribuição de tamanho variados operam com dados que caem entre essas duas extremidades. O cálculo desses parâmetros é regulamentado nos documentos ISO 13321:1996 E e ISO 22412:2008.

4. Polidispersidade

     No contexto do espalhamento de luz, polidispersidade e porcentagem de polidispersidade são derivadas do índice de polidispersidade, um parâmetro calculado através da análise cumulativa da função de autocorrelação de intensidade medida por DLS. Na análise de cumulantes, assume-se um único modo de tamanho de partícula, aplicando-se um ajuste exponencial simples à função de autocorrelação e a monodispersidade descreve a largura da distribuição Gaussiana assumida. Em análises proteicas, uma ‘% de polidispersidade’ inferior a 20% indica que a amostra é monodispersa. 

5. Coeficiente de Difusão (Diffusion Coefficient)

     As partículas e moléculas suspensas/solução estão em movimento browniano. Isto resulta do movimento térmico devido ao impacto dos solventes moleculares em movimento. Quando partículas ou moléculas são expostas a um feixe de laser, partículas menores movimentam-se mais rapidamente, pois são impactadas com maior força pelos solventes moleculares, resultando em variações da intensidade da luz espalhada que estão correlacionadas com o tamanho das partículas.

  A análise dessas variações de intensidade permite calcular a velocidade do movimento browniano, permitindo determinar o tamanho das partículas utilizando a relação de Stokes-Einstein. Assim, o coeficiente de difusão descreve o movimento browniano de uma substância ou partícula em um ambiente solutivo específico. Esse coeficiente de difusão translacional varia conforme a concentração e o tipo de íons no meio, além do tamanho das partículas e estrutura superficial.

6. Diâmetro Hidrodinâmico (Hydrodynamic Diameter)

     O tamanho hidrodinâmico medido pelo DLS é definido como o “tamanho de uma esfera ideal que difunde de maneira idêntica às partículas medidas”. Contudo, na realidade, as partículas ou macromoléculas em solução não são esféricas, são dinâmicas (rotacionais) e também solvatadas. Por isso, o diâmetro calculado a partir das propriedades de difusão das partículas reflete o tamanho aparente das partículas hidratadas/solvatadas dinamicamente. Assim nasceu o termo diâmetro hidrodinâmico. Portanto, o diâmetro hidrodinâmico ou diâmetro de Stokes é o diâmetro da esfera que tem o mesmo coeficiente de difusão translacional das partículas medidas, considerando a camada de hidratação ao seu redor.

7. Curva de Correlação – ou Função de Correlação

(Correlation Curve – or correlation function)

     Os dados medidos em experimentos de DLS são incorporados em uma curva de correlação que representa uma função de decaimento exponencial suave e de um tamanho único de dispersão de partículas. Toda a informação sobre a difusão das partículas amostradas está contida na curva de correlação. Ajustando a curva de correlação com uma função exponencial, o coeficiente de difusão (D) pode ser calculado (D é proporcional ao tempo total de decaimento exponencial).

  Ao conhecer o coeficiente de difusão (D), o diâmetro hidrodinâmico pode ser calculado usando uma modificação da equação Stokes-Einstein. Em amostras polidispersas, esta curva é a soma dos decaimentos exponenciais.

8. Intercepto (Y-Intercept or Intercept)

     No DLS, o intercepto Y ou mais simplesmente o intercepto se refere ao ponto de interseção da curva de correlação com o eixo y do gráfico de correlação. O ponto de intersecção y pode ser usado para avaliar a relação sinal-ruído da amostra medida e muitas vezes é empregado para determinar a qualidade dos dados. Está ajustado para que um sinal ideal apresente um valor de 1, bons sistemas ofereçam um intercepto superior a 0,6, e sistemas ótimos proporcionem um intercepto superior a 0,9.

9. Deconvolução ou Algoritmo de Deconvolução

(Deconvolution or Deconvolution algorithm)

     Maneira baseada em algoritmos para resolver uma mistura exponencial derivada de uma amostra polidispersa em vários valores de intensidade associados a faixas de tamanho individuais. As distribuições de tamanho de partícula, derivadas do DLS, são obtidas pela deconvolução da função de autocorrelação medida da intensidade da amostra. Comumente é realizada usando algoritmos de ajuste ao quadrado mínimo não negativo (NNLS). Um exemplo convencional seria CONTIN.

10. Taxa de Contagem ou Taxa de Contagem de Fótons

(Count Rate or Photon Count Rate)

     No DLS, esta é simplesmente a quantidade de fótons detectados, geralmente expressa em um padrão de “por segundo”. É útil na determinação da qualidade da amostra ao monitorar a estabilidade ao longo do tempo, além de ser usado para definir parâmetros do dispositivo e tempos de análise, como ajustes de atenuadores. A taxa de contagem deve ser acima de um valor mínimo para garantir sinal suficiente para análise. No entanto, todos os detectores possuem um limite máximo de resposta linear para a taxa de contagem, e recomendações do fabricante para ajuste devem ser seguidas se a taxa de contagem não for ajustada automaticamente.

11. Distribuição de Intensidade

     O principal resultado produzido pelos experimentos de DLS é a distribuição de intensidade de tamanho de partícula. A distribuição de intensidade é ponderada naturalmente pela intensidade de dispersão de cada seção ou fração de partículas. Para biomateriais ou polímeros, a intensidade de dispersão das partículas é proporcional ao quadrado da massa molecular. Assim, a distribuição de intensidade pode ser um pouco enganosa ao indicar dominância na distribuição por pequenas quantidades de aglomerações ou agregados, ou espécies de partículas maiores. Entretanto, tal distribuição pode servir como um detector sensível da presença de materiais maiores na amostra.

12. Distribuição de Volume

     A distribuição de tamanho base gerada por DLS é a distribuição de intensidade, mas pode ser convertida em uma distribuição de volume através do uso da teoria de Mie, que descreve a proporção relativa de componentes em uma amostra com base em volume ou massa, em vez de dispersão (intensidade).

  Ao converter uma distribuição de intensidade em distribuição de volume/massa, os seguintes quatro pressupostos são necessários:

• Todas as partículas serão esféricas
• Todas as partículas serão homogêneas
• As propriedades ópticas, como o índice de refração real e o componente imaginário das partículas, são conhecidas
• A distribuição de intensidade não terá erros

 Essa compreensão desses pressupostos é crucial, porque a própria técnica DLS gera uma distribuição inerente com ampliação de pico, portanto, sempre haverá alguns erros na declaração da distribuição de intensidade.

Por conseguinte, usa-se a boa prática de declarar o tamanho dos picos com base na análise de intensidade e relatar apenas porcentagens relativas (não tamanhos) oriundas da análise de distribuição de volume.