Artigo de Excertos de Livros: Avaliação Calorimétrica de Interações Intermoleculares Usando Calorimetria de Titulação Isotérmica (ITC)

Medicina Experimental Separata “Análise de Interações para Pesquisa de Desenvolvimento de Medicamentos: Perfeito” (Editora especializada em Ciências da Vida e Medicina Yodosha) Capítulo 1: Análise de Interações no Desenvolvimento de Medicamentos – I Desenvolvimento de Medicamentos de Moléculas Pequenas e Médias – 5 (Escrito por Akira Nagatoseki e Kohei Tsumoto) Apresentamos o artigo relacionado ao ITC publicado. Este artigo é publicado com a permissão da Yodosha.

Avaliação Calorimétrica de Interações Intermoleculares Usando Calorimetria de Titulação Isotérmica (ITC)

Akira Nagatoseki, Kohei Tsumoto

Objetivo e Pontos da Experiência

O ITC é um instrumento que detecta mudanças de calor em interações intermoleculares. A partir das mudanças de calor nas interações intermoleculares, é possível conhecer diretamente a qualidade termodinâmica da ligação não covalente, por exemplo, obtendo informações sobre o modo e especificidade de ligação dos compostos selecionados durante a triagem. Além disso, durante a otimização da estrutura, é possível analisar com precisão através de parâmetros termodinâmicos se as interações ocorrem conforme a estratégia de design. Ao combinar as informações estruturais, é possível examinar os fatores de design e conectá-los à próxima estratégia de design.

Introdução

A ligação de moléculas pequenas a proteínas no desenvolvimento de medicamentos de moléculas pequenas é a chave para suas interações específicas. Portanto, é importante obter percepções específicas em todos os estágios de exploração, validação e otimização. A formação de ligações não covalentes entre moléculas, mudanças na estrutura tridimensional de proteínas ou conformações, e as mudanças no estado de hidratação em solução, são todos fatores que resultam em reações exotérmicas ou endotérmicas. Portanto, a medição de calor fornece um indicador importante na análise de interações de moléculas alvo. A calorimetria de titulação isotérmica (ITC) é o único método analítico que pode observar as mudanças de calor nas interações que se deseja detectar, permitindo uma análise termodinâmica de alta precisão. Para o uso básico do ITC, consulte Capítulo 1-13.

Otimização: A especificidade esperada para a proteína alvo devido à validação resulta na confirmação de hit. A partir deste composto hit, a extensão do esqueleto e a adição/melhoria de grupos funcionais são feitas para melhorar a afinidade de ligação e a atividade funcional. Esta evolução estrutural é chamada de otimização.

Na otimização de fármacos de moléculas pequenas, é apresentado um exemplo importante de estudo retrospectivo sobre a utilidade de conhecimentos termodinâmicos. Os parâmetros termodinâmicos para a proteína-alvo do inibidor de protease do HIV, um medicamento para o tratamento da AIDS, são resumidos na Fig. 1A^1,2. Esta figura alinha inibidores desenvolvidos durante dez anos a partir do IDV, aprovado no início (1996), em ordem de aprovação. À medida que novos inibidores eram aprovados, observou-se uma tendência de maior afinidade de ligação com a proteína-alvo (ΔG mais negativamente alto). O perfil termodinâmico é notável (Fig. 1B).

Os fármacos iniciais (como IDV) eram impulsionados principalmente por entropia, com entalpia de ligação desfavorável, mas ganho de entropia favorável. No entanto, conforme os medicamentos eram otimizados, esse equilíbrio de parâmetros termodinâmicos mudou de um modelo impulsionado por entropia para um modelo impulsionado por entalpia (Fig. 1B). Nos inibidores iniciais, as contribuições de entropia eram dominantes, enquanto nos novos inibidores aprovados, a contribuição de entalpia era predominante. Além disso, as correlações de compensação ΔH-ΔS também podem ser vistas nesses inibidores. Tendências semelhantes foram observadas no tratamento da hipercolesterolemia com estatinas e no tratamento de osteoporose com bisfosfonatos^3,4. Esses resultados indicam que a alta especificidade para a proteína-alvo, ou seja, a contribuição tanto do modelo impulsionado por entalpia quanto do impulsionado por entropia, é um fator crucial na otimização do medicamento. Assim, interpretar as contribuições termodinâmicas de grupos funcionais na otimização e modificação estrutural para melhorar a eficácia de drogas proporciona insights valiosos na compreensão da qualidade de medicamentos de alvo molecular. Não é fácil definir quais grupos funcionais contribuem para a entalpia e quais contribuem para a entropia de forma geral, mas avaliar parâmetros termodinâmicos e projetar racionalmente os fármacos oferece informações importantes para a criação de especificidade no design de moléculas pequenas para proteínas-alvo.

Preparação

Para o método básico de preparo, consulte Capítulo 1-13. Quando utilizar compostos, como frequentemente contém DMSO, preste atenção meticulosa ao preparo para que não ocorram variações de concentração.

Protocolo

Para operações básicas e procedimentos experimentais, consulte Capítulo 1-13. Recomenda-se preparar a proteína no lado da célula e o composto no lado da seringa.

Resolução de Problemas

Atenção às Mudanças de Calor Causadas por DMSO
Ao utilizar compostos, geralmente a mistura da amostra contém DMSO, o que pode resultar em reações térmicas inesperadamente grandes ou calor de diluição. Assim como no SPR, o DMSO também afeta o calor de reação relacionado à interação no ITC. Como a preparação da amostra do lado da célula e a preparação da amostra do lado da seringa são realizadas separadamente, é importante garantir que as concentrações de DMSO não variem. Um pequeno erro de concentração de DMSO pode ser observado como calor de diluição, ocultando o calor de interação que se deseja detectar. É essencial medir sempre o calor de diluição apenas do composto para garantir que as mudanças de calor provenientes do DMSO sejam minimizadas ao preparar a amostra.

Exemplo Experimental 1: Uso da Medição ITC para Triagem Competitiva⁵⁾

A exploração de um espaço químico abrangente na superfície de proteínas-alvo de fármacos, para encontrar compostos de moléculas pequenas que se liguem especificamente às proteínas-alvo, é uma abordagem de triagem eficiente e eficaz. A estratégia de desenvolvimento de fármacos que ganha destaque atualmente é usar bibliotecas de fragmentos com massa molecular menor que 300 Da, menor que a média das bibliotecas de compostos usuais. No entanto, como os compostos de fragmentos possuem estruturas químicas relativamente simples, sua afinidade de ligação com as proteínas frequentemente é baixa, com constantes de dissociação na faixa de milimolares. Portanto, o ITC, capaz de abordagem analítica físico-química sensível, possui um valor de avaliação eficaz. Como no exemplo dos inibidores de protease do HIV mencionado anteriormente, é frequentemente observada uma reação exotérmica significativa com convergência da reação em ligações específicas. Quando se observa esse tipo de perfil, é provável que ocorra formação de ligações de hidrogênio. Por outro lado, em interações não específicas, não há convergência térmica observável, e interações hidrofóbicas podem resultar em reações endotérmicas. Assim, é desejável uma estratégia para selecionar os compostos que apresentam reação exotérmica entre os compostos detectados como hits. Nos casos onde o sítio de ligação à proteína alvo é conhecido, e substratos ou ligantes de moléculas pequenas conhecidos que se ligam ao sítio específico são envolvidos, a triagem competitiva é uma estratégia válida. Utilizando o ITC para realizar ensaios competitivos, é possível selecionar compostos hit específicos para o sítio de ligação que também exibem uma reação exotérmica (Fig. 2). A seguir, descrevemos um exemplo específico realizado pelos autores.

1. Proteína Alvo

As enzimas cetosteróide isomerase (KSI) e 3-oxo-Δ5 cetosteróide isomerase (que catalisam a isomerização de 3-oxo-Δ5 cetosteróides para isômeros conjugados com atividade hormonal) foram alvo.

2. Exploração de Moléculas Pequenas

Compostos foram selecionados da biblioteca de fragmentos para KSI por triagem SPR.

3. Ensaio Competitivo ITC (SITE)

Realizou-se uma validação eficiente dos hits selecionados pelo ensaio competitivo ITC. Esta técnica de análise consiste em co-existir a proteína alvo com os compostos selecionados na triagem e então adicionar uma molécula ligante conhecida à solução (Fig. 2A). Quando o fragmento interage no sítio de ligação desejado da KSI, um ligante conhecido de maior afinidade (deoxycholate: DOC) é adicionado como composto de controle positivo, desalojando o fragmento e estabilizando-o no local. Quando o fragmento interage com uma reação exotérmica, sua dissociação, promovida pela ligação do DOC, aparece como uma reação endotérmica.

Para aumentar a velocidade do processo, foi inventado o método SITE, que permite uma avaliação dos ensaios competitivos térmicos em uma única injeção. Com esse método, foi validada a ligação dos fragmentos à KSI. O resultado foi a obtenção de um composto hit com comportamento exotérmico conduzido por entalpia que competia com o substrato DOC da KSI, mostrando uma reação exotérmica significativa (Fig. 2B). Este método também foi eficaz na triagem de compostos a partir do fragmento tampão da proteína quinase ERK2, envolvida na cascata de sinalização MAPK, uma via de sinalização celular.

Assim, o ITC demonstra seu poder não apenas na otimização de drogas, mas também na avaliação térmica na fase exploratória do desenvolvimento de medicamentos. As reações exotérmicas são geralmente associadas a ligações específicas, que frequentemente envolvem ligações de hidrogênio, consideradas responsáveis pela criação de especificidade nas ligações não covalentes. No entanto, desenvolver ligações de hidrogênio de forma racional é considerado desafiador. Nesse contexto, identificar compostos de pequenas moléculas que formam ligações de hidrogênio, mesmo no estágio inicial do design do fármaco, e então expandir a síntese a partir destes, pode tornar-se uma abordagem útil para gerar compostos líderes de alta qualidade.

Exemplo Experimental 2: Análise ITC na Otimização de Moléculas Pequenas⁶⁾

1. Proteína Alvo

A proteína DJ-1, que está profundamente envolvida em doenças como Parkinson e câncer, foi selecionada como alvo (Fig. 3A). DJ-1 é conhecida como uma enzima que demonstra atividades como a de glioxalase, embora a relação entre essa atividade enzimática e doenças ainda não esteja totalmente clara. A pesquisa buscou elucidar a relação entre a atividade enzimática de DJ-1 e as doenças por meio da identificação de compostos com atividade inibitória sobre DJ-1, esperando-se potencialmente aproximar-se de novas terapias.

2. Exploração de Moléculas Pequenas

Vários compostos candidatos a hit foram selecionados da triagem SPR. Entre esses, identificou-se um composto contendo uma estrutura de isatina como um candidato hit promissor (Fig 3B).

3. Validação de Hits (ITC)

Foi mantida uma medição ITC nos compostos candidatos a hit, que revelaram que a isatina apresentava um modo de ligação conduzido por entalpia exotérmica com DJ-1 (ΔH = -11,6 kcal/mol, –TΔS = 4,1 kcal/mol, K_D = 3,2 μM) (Fig. 3C). –TΔS é derivado da equação ΔG = ΔH – TΔS e K_D é calculado a partir de K_A = 1/K_D. Análises térmicas adicionais de estabilidade do DJ-1 usando DSF (differential scanning fluorimetry) mostraram que a isatina também aumentou a estabilidade térmica do DJ-1.

4. Análise Estrutural

Análises estruturais de cristalografia de raio-X co-cristalizadas de Isatin com DJ-1 identificaram um complexo único, onde Isatin forma ligações covalentes e não-covalentes com várias cadeias laterais de aminoácidos no DJ-1 (Fig. 4A, B). Com base nessas informações estruturais, foi realizada uma análise de mutação, sugerindo que a interação de Isatin com o DJ-1, conforme observada em solução, espelha a mesma no sítio de ligação observado nos cristais (Fig. 4C).

5. Otimização de Compostos

Tentou-se melhorar a afinidade do composto com base nas informações estruturais desse complexo. Como resultado, foi identificado o composto #15, que mostra uma afinidade de ligação na ordem de nM (Fig. 5). O composto #15 contribuiu significativamente para a entropia (ΔH = -11,5 kcal/mol, –TΔS = 2,0 kcal/mol, K_D = 0,1 μM). Este composto também aumentou a estabilidade do DJ-1. Para esse composto hit obtido, juntamente com o Isatin, a atividade inibitória foi verificada in vitro usando células. Descobriu-se que ambos, Isatin e composto #15, inibem a atividade de glioxalase nas células. Interessantemente, esses compostos mostraram, através do ensaio de mudança térmica baseado em células (CETSA), aumentar significativamente a estabilidade térmica do DJ-1 in vitro. Esses resultados juntamente sugerem que a validação por ITC permite a seleção de compostos conduzidos por entalpia que criam especificidade, e que o ajuste estrutural demonstra como a entropia pode contribuir na criação de complementação estrutural. Esta abordagem ITC é eficaz para selecionar compostos que tenham ação específica sobre proteínas-alvo, mesmo in vitro.

Conclusão

Este capítulo apresentou exemplos de investigação relacionados ao desenvolvimento de medicamentos de moléculas pequenas utilizando medições de calor. Para a busca de inibidores de moléculas pequenas, é comum realizar seleções com base na alta atividade biológica, atividade inibitória e alta afinidade de ligação. No entanto, muitas vezes essa busca avança sem entender claramente os modos de interação entre a molécula-alvo e a droga, o que pode resultar em problemas como não atingir o design do líder ou ter uma correlação estrutura-atividade pobre na otimização estrutural. Além disso, recentemente as moléculas alvo (principalmente proteínas) não se limitam a enzimas ou receptores, e muitos alvos difíceis, como proteínas de membrana e proteínas naturalmente desordenadas, são difíceis de manipular bioquimicamente. Assim, o manuseio das moléculas-alvo está se tornando cada vez mais desafiador. Com alvos de manuseio difícil, os métodos tradicionais de pesquisa de drogas e sistemas de ensaio muitas vezes não são aplicáveis. Além disso, os inibidores de moléculas pequenas nem sempre têm um sítio de ligação claro, como o bolso de um substrato enzimático, e devem atuar em interações proteína-proteína (PPI) ou interfaces de complexos proteicos macromoleculares, aumentando sua complexidade. Para selecionar compostos que se ligam especificamente a proteínas-alvo, a capacidade de detectar comportamentos de ligação de forma sensível e quantitativa é essencial. Dado esse contexto de muitos desafios em desenvolvimento de medicamentos com alvo molecular, o que é mais necessário é a geração de alta afinidade de ligação e especificidade do fármaco para a molécula-alvo. Para isso, tecnologias de exploração e análise mais precisas são exigidas. Este capítulo explicou a utilidade do ITC como uma dessas tecnologias. Embora não tenha sido introduzido neste capítulo, outras aplicações do ITC na busca de inibidores de moléculas pequenas foram realizadas pelos autores. Para exemplo, foi identificado que dois compostos selecionados na triagem de inibidores de moléculas pequenas para a enzima de metabolismo da serina (SHMT), devido ao alto interesse em alvos como infecção por malária e câncer, são compostos hit impulsionados por entalpia e por entropia respectivamente⁷. O perfil térmico por ITC pode ser uma ferramenta útil tanto para especificação de compostos hit como para racionalização de design molecular durante a otimização estrutural de moléculas.

◆ Referências
1) Ohtaka H & Freire E: Prog Biophys Mol Biol, 88: 193-208, 2005
2) Muzammil S, et al: J Virol, 81: 5144-5154, 2007
3) Carbonell T & Freire E: Biochemistry, 44: 11741-11748, 2005
4) Kawasaki Y, et al: Chem Pharm Bull (Tokyo), 62: 77-83, 2014
5) Kobe A, et al: J Med Chem, 56: 2155-2159, 2013
6) Tashiro S, et al: ACS Chem Biol, 13: 2783-2793, 2018
7) Nonaka H, et al: Nat Commun, 10: 876, 2019

Calorímetro de Titulação Isotérmica (ITC) da Malvern Panalytical
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