Por que LALS é melhor quando mais próximo? – Sistema Viscotek GPC
Introdução
Atualmente, em experimentos de GPC/SEC (cromatografia de permeação em gel/exclusão por tamanho) o uso do detector de espalhamento de luz a laser é amplamente adotado para medir massa molar.
A vantagem do detector de LS (espalhamento de luz), proporcionando leitura direta da massa molar, faz com que não seja necessário corrigir o volume de eluição usando polímeros ou proteínas padrão, tornando-o preferido por muitos usuários. Além disso, a massa molar medida pelo detector LS é independente do tipo e estrutura do polímero.
Por este motivo, a massa molar medida por GPC-LS é referida como molecular absoluta. Na prática, a calibração é essencial para todos os detectores GPC-LS. No entanto, a maioria dos detectores LS atualmente utilizados obtém a massa molar através de extrapolação ou correção de dados, assim, distanciando-se do conceito de valor absoluto.
Esta nota de aplicação discute a teoria associada ao problema e descreve se LALS (espalhamento de luz de baixo ângulo) é a única tecnologia LS que mede o ângulo de luz dispersa proporcional à massa molar
Teoria do Espalhamento de Luz
Primeiro, precisamos examinar a correlação entre a capacidade medida (intensidade da luz espalhada) e o resultado desejado (peso molecular médio). Esses dois fatores estão relacionados pela bem conhecida equação de Rayleigh.
Atualmente, Rθ = 0 é a intensidade da dispersão a 0 graus, Mw é a massa molar média, c é a concentração da solução, e K é a constante óptica que representa dn/dc, enquanto A2 representa o segundo coeficiente virial.
Para soluções de baixa concentração (e.g., condições típicas de GPC), o efeito da concentração é desprezível, simplificando a equação conforme mostrado abaixo:
Usando essa equação simplificada, Mw pode ser diretamente calculada a partir da intensidade da luz espalhada. Contudo, é crucial entender que esta fórmula se aplica à dispersão de luz a 0 graus (e.g., 0°).
Claro, devido ao feixe de laser, não é possíveis medições a 0°, necessitando de medições a diversos ângulos (ver Figura 1). Contudo, isso complica o processo, pois a magnitude da luz espalhada varia consideravelmente com o ângulo e tamanho molecular.
Para pequenas moléculas, esse efeito angular é negligenciável. Mas, para moléculas superiores a 12 nm, problemas surgem em solução. (1)
A teoria apresenta três soluções.
1. MALS – Multi-angle Light Scattering.
Medição de luz espalhada a múltiplos ângulos para extrapolação a 0°.
2. RALS/Viscosity – Espalhamento a 90°/Viscosidade.
Medição a 90° ajustada usando viscosidade para 0°.
3. LALS – Low Angle Light Scattering.
Medição próxima a 0° elimina efeitos angulares e a necessidade de correção.
Equipamentos MALS ou RALS/Viscosity são amplamente usados, mas nenhum mede diretamente a massa molar.
O método Multi-angle se baseia em extrapolação; RALS usa viscosidade para moléculas maiores.
Historicamente, LALS foi considerado o único método absoluto, não necessitando de extrapolação como o método Multi-angle.
Equipamentos comerciais LALS como o Chromatix KMX-6 foram produzidos entre os anos 70 e 80. Em 2001, um novo detector LALS foi lançado por Viscotek, permitindo medições absolutas novamente.
Por que o metodo Multi-angle é problemático
&
Equipamentos Multi-angle aplicam a extrapolação das medições a 0°. No entanto, muitos usuários pensam que os valores são massas absolutas. Mas, como a calibração é essencial para MALS, isso não é verdade. A massa molar é medida por extrapolação, não diretamente.
O maior problema do método MALS é a dependência de extrapolação, onde várias plotagens ou ajustes são possíveis. Para moléculas pequenas, ajustes lineares são precisos; para maiores, ajustes complexos são necessários. (2)
Para moléculas acima de 45 nm, plots resultam em curvatura, variando a massa extrapolada conforme o ajuste. Em amostras com variadas massas, o método de ajuste impacta.
A falta de dados nos ângulos baixos é um problema do método Multi-angle, pois não captura dados precisos nesses ângulos.
Consequentemente, a precisão depende da proximidade do menor ângulo ao 0° e da qualidade do sinal. (3)
LALS – Espalhamento de Luz de Baixo Ângulo
O método LALS avançado mede luz espalhada cerca de 0° (neste caso 7°), evitando problemas de extrapolação e ajustes.
Figura 2 mostra um esquema do caminho ótico interno do detector, separando efetivamente o feixe de luz incidido do espalhado, resultando em excelente sinal-ruído a 7°.
Além disso, LALS supera clerigados, especialmente para grandes moléculas como polissacarídeos, onde o método RALS/Multi-angle falharia devido à alta dependência angular.
Medições diretas a 7° eliminam extrapolações ou ajustes, permitindo cálculos precisos. Figura 4 ilustra resultados com ácido hialurônico medidos via LALS. (5)
Conclusão
Detecção LALS inovadora torna precisa medição da massa molar GPC/SEC. O LALS evita problemas de extrapolação ou ajustes. Compacto e fácil, pode integrar-se a sistemas multi-detecção com viscosímetros, permitindo determinar massa e estrutura moleculares. (6-8)
Isto desafia a noção do quão bom é ter múltiplos ângulos. Na verdade, mais próximo, melhor.
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