MicroCal PEAQ-ITC com solventes orgânicos: Dicas e precauções

por Verna Frasca, Tuesday, 23rd June 2020

Resumo

Há um crescente interesse em aplicações de Calorimetria de Titulação Isotérmica (ITC) que requerem a dissolução dos parceiros de ligação em um solvente orgânico. Isso inclui reações químicas do tipo hóspede: hospedeiro, nanopartículas e materiais insolúveis. Para resultados satisfatórios, o protocolo experimental com solventes orgânicos requer uma modificação leve dos métodos normais com tampões aquosos. Este blog inclui dicas para realizar experimentos bem-sucedidos com solventes orgânicos em um sistema MicroCal PEAQ-ITC.

Se você estiver utilizando outro MicroCal ITC ou tiver mais perguntas, entre em contato com o escritório local da Malvern Panalytical ou o help desk.

Antes de usar solventes orgânicos com um MicroCal PEAQ-ITC ou outro sistema MicroCal ITC, por favor revise estas precauções antes de quaisquer experimentos:

  • A Malvern Panalytical não testou todos os componentes do instrumento com todos os solventes orgânicos. Você pode obter uma lista completa dos componentes em contato com os líquidos no guia do usuário do MicroCal PEAQ-ITC, ou no escritório da Malvern Panalytical da sua região (uma lista parcial está abaixo). O MicroCal VP-ITC e iTC200 usam alguns materiais diferentes.
  • Consulte guia(s) de resistência química para mais informações sobre componentes específicos do instrumento e solvente(s) de interesse. Há vários guias disponíveis online.
  • Limite o tempo de exposição do PEAQ-ITC a solventes orgânicos e remova completamente os solventes orgânicos após o uso. Não mantenha solventes orgânicos nas células de ITC ou seringas. Limpe qualquer derramamento imediatamente.
  • É possível que gases voláteis dos solventes penetrem na eletrônica do instrumento e danifiquem o núcleo da célula. Isso é um reparo caro.
  • Não utilize solventes orgânicos com o módulo de lavagem do PEAQ-ITC ou o amostrador automático para o PEAQ-ITC Automático, a menos que o solvente seja conhecido por ser compatível com TODOS os componentes do instrumento.
  • Conheça os riscos humanos e ambientais dos solventes orgânicos e as medidas preventivas. Utilize solventes orgânicos em um laboratório bem ventilado e com o equipamento de proteção individual apropriado. Descarte os resíduos de solventes orgânicos por métodos apropriados.

Aqui está uma lista de solventes conhecidos por serem compatíveis com o MicroCal PEAQ-ITC:

  • Tampões aquosos entre pH2-pH12
  • 1 M NaCl
  • 50% DMSO
  • 50% acetonitrila
  • 100% Metanol
  • 50% Etileno glicol
  • 20% Contrad 70
  • 14% Decon 90

Lista parcial de materiais em contato com líquidos no MicroCal PEAQ-ITC – Confira os guias de resistência química para solventes específicos. Esta lista não inclui todos os componentes em contato com líquidos do módulo de lavagem e todos os materiais usados no amostrador automático PEAQ-ITC.

  • Liga Hastelloy C276: células ITC
  • Acetal (também chamado de Delrin): copos de transbordamento de porta de célula ITC
  • Aço inoxidável 316: Seringa de injeção, seringa de carregamento manual de célula, portas de célula ITC
  • Aço inoxidável 303: Porca da seringa de injeção
  • PEEK: Adaptador de porta de preenchimento (FPA), módulo de lavagem
  • Kalrez: Adaptador de porta de preenchimento (FPA)
  • PTFE: Pipeta de injeção, manga de rolamento da seringa de injeção, seringa de carregamento manual de célula
  • Vidro borossilicato: Seringa de injeção, seringa de carregamento manual de célula
  • Tygon 2375: Tubulação para módulo de lavagem e montagem FPA
  • Polipropileno: Conexões rápidas para módulo de lavagem e montagem do Adaptador de Porta de Preenchimento (FPA)
  • FEP (fluoreto de propileno etileno): proteção para seringa de carregamento manual da célula
  • NOTA: alguns solventes orgânicos podem amolecer os tubos de 0,2 mL usados para encher a seringa de injeção e degradar o adesivo usado para montar a seringa de carregamento manual da célula.

Como realizar experimentos com solventes orgânicos

Preparação da amostra com solventes orgânicos:

  • Cada parceiro de ligação para a titulação ITC precisa estar em solventes idênticos. Qualquer incompatibilidade devido a outro solvente ou aditivo resultará em grande calor de fundo.
  • Use solventes secos, fornecidos em ampolas seladas ou secos com peneiras moleculares. Isso reduzirá a contaminação por água durante o experimento ITC.
  • A amostra deve ser pura, sem materiais adicionais, aditivos, solventes, etc.
  • Pese cuidadosamente as amostras e misture com o solvente. Use imediatamente para evitar mudanças de concentração, contaminação por umidade, etc.
  • Se precisar substituir um solvente por outro antes do ITC, certifique-se de que todo o solvente inicial foi removido da amostra por meio de um método apropriado (ou seja, liofilização).
  • Se estiver usando um solvente misto (ou seja, 50% acetonitrila/50% água): eles são muito difíceis de igualar exatamente. Certifique-se de realizar titulações de controle apropriadas.
  • Degasser as amostras antes do ITC pode não ser eficaz para solventes orgânicos. Tenha cuidado com a possível liberação de gases ao encher a célula ITC e a seringa.
  • Se estiver usando um solvente volátil, observe que as concentrações de amostra na célula ITC e na seringa provavelmente mudarão durante o armazenamento e durante o experimento ITC devido à evaporação do solvente.

Preparação das células MicroCal PEAQ-ITC e seringa de injeção para experimentos com solventes orgânicos

Antes do 1o  experimento:

  • Limpe as células de amostra e referência ITC e a seringa de injeção com 20% de Contrad 70 (ou 14% de Decon 90), seguidos por vários enxágues de água para remover proteínas e outros contaminantes. Repita a limpeza se necessário. Remova a água.
  • Enxágue a seringa de injeção ITC com metanol e depois seque com a bomba PEAQ-ITC para remover o metanol.
  • Enxágue as células de amostra e referência ITC com metanol, usando a seringa de preenchimento manual de célula. Remova o metanol.
  • Com as células ITC vazias, termostate a 60°C, por 30-60 minutos para evaporar o metanol. Isso secará as células ITC.
  • Termostate as células ITC à temperatura experimental.
  • Encha a célula de referência com solvente experimental (não use água).
  • Encha a célula de amostra com a amostra no solvente.
  • Encha a seringa de injeção com a amostra no solvente.

Entre experimentos com o mesmo solvente:

  • Remova a amostra da célula de amostra com a seringa de carregamento manual da célula. Enxágue a célula com o solvente várias vezes usando a seringa de carregamento manual da célula. Encha a célula de amostra com nova amostra + solvente.
  • Enxágue a seringa ITC várias vezes com solvente. Use o adaptador de porta de preenchimento conectado à seringa, ignorando o módulo de lavagem do PEAQ-ITC. Encha a seringa com amostra + solvente.
  • Substitua o solvente na célula de referência se tiver ocorrido evaporação.

Após o experimento final em solvente orgânico:

  • Remova a solução de solvente das células de amostra e referência com a seringa de carregamento manual da célula. Se o solvente não for miscível com água, enxágue as células ITC várias vezes com metanol com a seringa de carregamento manual da célula. Siga com lavagem de solução de água e detergente. Enxágue com água e deixe água fresca nas células de amostra e referência.
  • Se o solvente não for miscível com água, enxágue a seringa ITC várias vezes com metanol, depois com água e solução de detergente. Enxágue com água e metanol, guarde a seringa seca.
  • Se o solvente não for miscível com água, enxágue a seringa de preenchimento manual da célula várias vezes com metanol, depois com solução de água. Guarde a seringa seca.
  • Certifique-se de que qualquer derramamento de solvente orgânico sobre o instrumento seja limpo.

Design experimental sugerido e experimentos de controle

  • Para MicroCal PEAQ-ITC: 25 °C, 19 X 2 µL injeções, intervalo de 150 segundos, agitação de 500-750 rpm (sugere-se velocidade de agitação abaixo de 1000 rpm para solventes orgânicos).
  • Pode ser necessária uma velocidade de agitação mais lenta para reduzir o ruído de linha de base entre as injeções e/ou uma temperatura diferente.
  • Se a linha de base mudar, isso pode ser devido a bolhas na célula ITC e/ou seringa.
  • É importante realizar várias titulações de controle ITC para garantir que as mudanças de calor observadas sejam devidas à ligação, não a outro processo ou de incompatibilidade de solvente
    • Água titulada em água: este é o teste recomendado para a função geral do ITC.
    • Solvente titulado em solvente.
    • “Ligante/hóspede” + solvente na seringa ITC, titulado apenas em solvente na célula ITC.
    • Somente solvente na seringa ITC, titulado em “macromolécula/hospedeiro” + solvente na célula ITC.
    • Todos esses experimentos de controle devem proporcionar mudanças pequenas e reprodutíveis por injeção, com baixo ruído.
  • Se as mudanças de calor por injeção forem maiores do que o esperado para os controles e/ou experimentos, procure fontes de contaminação por umidade e incompatibilidades de solvente e certifique-se de que as células ITC e a seringa foram limpas.
  • Se não houver evidência de ligação e/ou saturação de ligação, verifique também as concentrações.

Exemplo: Interação hóspede-hospedeiro em Acetonitrila

  • Dados brutos do ITC (topo) e ajuste dos dados a um modelo de conjunto de locais (fundo) para reação de reconhecimento hóspede-hospedeiro em acetonitrila.
  • “Hóspede” na seringa a 17,5 mM e “hospedeiro” na célula a 0,7 mM.
  • Experimentos realizados com MicroCal PEAQ-ITC, analisados com o software PEAQ-ITC.
Dados brutos do ITC (topo) e ajuste a um modelo de conjunto de locais (fundo) para a reação de reconhecimento hóspede-hospedeiro em acetonitrila

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