Medida de Mobilidade Eletroforética de Proteínas – Zetasizer Nano ZSP

Medição da Mobilidade Eletroforética de Proteínas Usando o Zetasizer Nano ZSP  

 

 

Introdução  

 


   O Zetasizer Nano é um produto líder no mercado para medição do tamanho hidrodinâmico e mobilidade eletroforética usando técnicas de espalhamento de luz dinâmico e eletroforético.  

 

   O espalhamento de luz dinâmico (DLS) é um método amplamente utilizado para análise das características das proteínas e suas formulações, permitindo não apenas a medição do tamanho molecular como também a avaliação da estabilidade.  

 

   Recentemente, devido ao uso crescente de proteínas como terapias biológicas, a estabilidade das proteínas em solução tem gerado grande interesse tanto sob o ponto de vista cientifico quanto comercial. Compreender a estabilidade e comportamento das formulações é crucial para desenvolver produtos seguros e comercializáveis, aumentando a demanda por ferramentas que possam analisar essas características.  

 

   A mobilidade de proteínas medida utilizando espalhamento de luz eletroforético (ELS) é um dos indicadores de comportamento e estabilidade de viscosidade da formulação [1].
 

   Medir a mobilidade de proteínas experimentalmente apresenta dois desafios práticos.  

 

(i) Manipular soluções de proteínas geralmente envolve lidar com concentrações diluídas. O DLS implica em lidar com baixos níveis de luz dispersa proporcional ao tamanho molecular. Muitos equipamentos de base para espalhamento de luz lançados até agora não possuíam sensibilidade necessária para tais medições.  

 

(ii) Para medir a mobilidade de proteína, um campo elétrico deve ser aplicado à amostra, o que pode promover agregação e danificar a proteína [2]. Como resultado, os resultados de medição de mobilidade tendem a refletir a agregação de moléculas ao invés das proteínas alvo. 

 


Para medições precisas e exatas da mobilidade de proteínas, são necessários três requisitos.
1. Equipamento com suficiente sensibilidade para medir baixas taxas de contagem e baixa mobilidade eletroforética em relação a soluções diluídas de proteínas
2. Técnicas de medição que minimizem o risco de agregação
3. Procedimentos automáticos inteligentes que reconheçam e minimizem a formação de agregação  

   O Zetasizer Nano ZSP (ZSP, Figura 1A) e o software associado foram especialmente desenvolvidos para satisfazer essas solicitações. Possibilita a análise de amostras com baixos limites de concentração, cerca de 1mg/mL como a lisozima, dependendo da sensibilidade de espalhamento de luz do equipamento. Além disso, a técnica de dispersão de fase (PALS) utilizada no ZSP otimiza o desempenho da medição de amostras de baixa mobilidade, como proteínas. 

 

   Cientistas da Malvern Instruments identificaram que grande parte da agregação no processo de medição eletroforética acontece nos eletrodos [3]. Ao utilizar o método patenteado de barreira de difusão da Malvern Instruments (Figura 1B), a amostra de proteína pode ser protegida da célula de eletrodos [2, 4].  

 

   Isto significa que a voltagem pode ser aplicada por períodos mais longos para obtenção de dados mais confiáveis do equipamento [3]. O método de barreira de difusão foi incorporado nos mais recentes padrões ASTM para medição de mobilidade em materiais biológicos nanoestruturados [2]. 

 


   O software Zetasizer para Zetasizer Nano ZSP inclui um protocolo específico para medir a mobilidade de proteínas. Esta técnica reduz a voltagem e controla cuidadosamente a temperatura dentro da célula para prevenir agregação. 

 

   Antes e depois da medição de mobilidade, o sistema mede também os tamanhos das partículas utilizando exatamente os mesmos dispositivos ópticos (Figura 2). Assim, a distribuição de tamanho das partículas medidas reflete diretamente a subpopulação de proteínas cuja mobilidade está sendo medida. Se optasse por utilizar um diferente dispositivo óptico para medir os tamanhos das partículas, a intensidade da luz espalhada poderia variar, impossibilitando a identificação dos agregados formados, portanto é preferível medir com o mesmo dispositivo ótico. Medindo os tamanhos das partículas antes e depois da mobilidade com o mesmo conjunto óptico, o Zetasizer Nano ZSP identifica qualquer agregação aleatória que poderia ter ocorrido durante o procedimento de medição.

 


   Por fim, medir com precisão a mobilidade eletroforética das proteínas permite calcular a carga protéica com base na conhecida relação entre mobilidade e carga proteica [5].  

 

   Isto pode ser calculado usando a nova opção de calculadora do software do Zetasizer. Esta nota de aplicação fornece a descrição sobre a medição da mobilidade das proteínas utilizando ZSP. Utilizando a sensibilidade do ZSP, o método de barreira de difusão, e protocolos de medição adequados, é possível obter valores de medição diversos.
 

Métodos
 

   Albumina sérica humana (HSA) foi preparada utilizando dois tipos de tampões para alcançar uma concentração final de aproximadamente 2mg/ml. As condições do tampão são como se seguem. 

 

 1) Tampão pH7 onde a proteína original foi dissolvida, 2) Tampão de citrato pH4.3. Antes de iniciar a medição, a amostra é filtrada usando um filtro de 0.02μm para excluir o efeito dos agregados.  

 

   Usando o método de barreira de difusão, é possível prevenir o contato da amostra com os eletrodos da célula e prevenir agregação. Coloque uma quantidade apropriada de tampão na célula capilar dobrada descartável. Usando a ponta de uma pipeta de carregamento de gel, aplique 20μL de HSA (2mg/ml) na parte inferior da célula onde a luz passa. Insira a célula no equipamento e meça o tamanho e potencial zeta. 

 

   O tamanho hidrodinâmico e a mobilidade do HSA são medidos usando o Zetasizer Nano ZSP por DLS e ELS, respectivamente. Tanto o tamanho quanto a mobilidade são então medidos no mesmo ângulo de dispersão para garantir que o potencial zeta medido seja da proteína e não de óxidos agregados. 

 


Resultados 

 


    

   As Figuras 3A e 3D mostram a distribuição do tamanho das amostras medidas no início dos experimentos em pH 7 e pH 4.3, respectivamente. Como previsto, confirmou-se a existência de apenas um pico na distribuição de tamanhos. O tamanho no pH 7 é de 3.8nm, bem consistente com dados reportados sobre HSA. 

 

   Curiosamente, o tamanho no pH 4.3 é de 4.1nm, um pouco maior que no pH 7. Não é possível determinar através desse método se isso se deve a alterações estruturais ou elevações nos níveis de reações de oligomerização ou se representa um sinal inicial de agregação. 

 

   Em seguida, a medição da mobilidade da amostra é iniciada e os resultados são calculados. As Figuras 3B e 3E apresentam os gráficos de frequência durante a medição de mobilidade. Estudar o gráfico de frequência é uma forma eficaz de avaliar a qualidade das medições [6]. 

 

   Devido ao pequeno tamanho das proteínas, estas se difundem rapidamente. Durante a medição eletroforética, enquanto estão em um estado eletroforético, a velocidade de difusão não é totalmente superada pela eletroforese.  

 

   Como resultado, há um aumento significativo na componente de difusão no desvio de frequência de luz dispersa, o que se manifesta em picos largos. Amostras contendo agregados com gráficos de frequência têm componente de difusão significativamente menor, tendo como característica picos muito altos e acentuados. Esses conceitos são mais detalhadamente apresentados nas notas técnicas MRK1651-02 e na referência [4]. O gráfico de frequência aqui apresenta picos largos e rasos, sinalizando que a medição foi principalmente direcionada às proteínas e não aos agregados.
 

   A mobilidade eletroforética medida para o HSA em pH 7 é de -0.88±0.2μmcm/Vs e, no pH 4.3, é de 0.44±0.2μmcm/Vs. Esses resultados confirmam que o ponto isoelétrico da amostra situa-se entre esses dois pontos de pH. 

 


   Após medir a mobilidade eletroforética, utilizando a nova calculadora do software Zetasizer, a carga total das proteínas pode ser calculada a partir dos tamanhos hidrodinâmicos e mobilidade eletroforética. Na Figura 4, a carga calculada de HSA em pH 7 é cerca de -18, enquanto em pH 4.3 a carga calculada é aproximadamente +10. 

   As Figuras 3C e 3F mostram distribuições de tamanho de amostras após a medição de mobilidade. Os resultados revelam ocorrência mínima de agregação durante as medições.  Em ambos os casos, pH 7 destaca-se com 99% da luz dispersa no pico principal da distribuição e, pH 4.3, com 90% da amostra.

 

   Portanto, estes resultados derivados das mobilidades aparecem confiáveis. O comportamento da amostra em pH 4.3 mostra agregação com o tempo na ausência do campo elétrico, um efeito provavelmente induzido pelas condições de pH baixo.  Este fenômeno explica a ligeira agregação observada durante a medição.

 


Discussão 

 


   Os resultados gerais fornecem mobilidades medidas que são compatíveis com valores já conhecidos. Além disso, as mobilidades medidas das proteínas são mais precisas em valores de pH baixos, como era de se esperar. A repetibilidade e a precisão das medições conferem grande confiança à precisão dos resultados. Isto é corroborado pelas medições subsequentes de DLS, apresentando gráficos de frequência largos e níveis mínimos de agregação.
 

   A carga de proteína calculada foi comparada ao estudo de Tanford [2]. Tanford mostrou que em pH7, o HSA possui uma valência de cerca de -16, indicando que os resultados obtidos são compatíveis com as medições aqui apresentadas. Em pH 4.3, Tanford apontou uma valência de cerca de +20.  

 

   Os dados aqui apresentados são bem alinhados, indicando que a diferença se deve a múltiplas razões potenciais, incluindo as fontes de tampões e HSA utilizadas nos experimentos. Contudo, a correlação geral entre os valores esclarece-se por meio da referência [6]. 

 


   O uso do Zetasizer Nano ZSP, seu software e o método de barreira de difusão, garantem a precisão e confiabilidade das medições durante procedimentos reais. Isto é alcançado de três maneiras distintas.  

 


   1. O método de barreira de difusão previne a agregação da amostra de proteína nos eletrodos.
   2. O software Zetasizer automatiza a otimização e medição de tamanho e potencial zeta, melhorando a precisão e diminuindo a necessidade de interferência do usuário.
   3. Utilizando o Zetasizer Nano ZSP para medir tamanho e potencial zeta com o mesmo conjunto óptico e sensível, garante confiança na precisão das medições para o usuário.  

 


   Em conclusão, a mobilidade HSA foi medida com sucesso em concentrações de 2mg/mL em tampões pH7 e pH4.3. O método de barreira de difusão requer apenas pequenas quantidades de amostra de proteína (neste caso, 20μL), permitindo a realização destas medições de maneira econômica.  

[1] Laue, Proteins in Serum – Colloids vs molecular views, presentation at Colorado Protein Stability Conference, 2011
[2] ASTM2865 – Standard guide for measurement of electrophoretic mobility and zeta potential of nanosized biological materials
[3] Corbett, Connah & Mattison, Electrophoresis. In press 2011
[4] Corbett, Connah & Mattison, Patent Pending
[5] Loeb, A.L, Wiersema, P.H. and Overbeek, (1961) “The Electrical Double Layer around a Spherical Colloid Particle” MIT Press, Cambridge Mass
[6] Corbett & Jack, Colloids & Surfaces A: Physiochemical and Engineering Aspects. (2010) 376 pp31-41