Raio Hidrodinâmico – Raio de Giração

O tamanho importa: Raio Hidrodinâmico Vs Raio de Giração (Rh versus Rg)

Bem-vindo à segunda parte da série de blogs que segue o nosso webinar da C&EN sobre as análises qualitativas e quantitativas de proteínas.

Nesta série de blogs, estamos abordando algumas das perguntas interessantes feitas pelos membros da audiência. Hoje, vamos analisar a diferença entre raio hidrodinâmico (Rh) e raio de giração (Rg), e o que eles significam para a caracterização de proteínas.

Dos muitos parâmetros que descrevem o tamanho de uma molécula, os dois mais comumente usados são o raio hidrodinâmico (Rh) e o raio de giração (Rg). Ambos esses parâmetros indicam quão grande ou pequena sua molécula é, mas usam meios diferentes para chegar a um valor de tamanho… e, talvez mais confusamente, suas respostas não serão as mesmas, mas nenhuma delas está errada!

O Rh, medido por espalhamento de luz dinâmico, é definido como o raio de uma esfera rígida equivalente que difunde à mesma taxa que a molécula em observação. Na realidade, soluções de proteínas e seus complexos não existem como esferas rígidas e, assim, o raio hidrodinâmico determinado reflete mais de perto o tamanho aparente adotado pela molécula solvata e em movimento. Por outro lado, Rg é definido como a média ponderada da distância de massa do núcleo de uma molécula para cada elemento de massa na molécula. Para macromoléculas com raios superiores a 10 nm, o Rg é classicamente determinado usando espalhamento de luz com múltiplos ângulos; uma técnica que se baseia na medição de uma diferença na intensidade da luz espalhada em diferentes ângulos ou conhecida como dependência angular. Moléculas com raios menores que 10 nm – representando a maioria das proteínas conhecidas – espalham luz igualmente em todos os ângulos (espalhamento Rayleigh) e, portanto, não apresentam dependência angular. Consequentemente, Rg não pode ser determinado para proteínas dessa forma. No entanto, é possível obter Rg para proteínas e pequenas moléculas utilizando outras técnicas, como espalhamento de nêutrons em pequenos ângulos (SANS) e espalhamento de raios X em pequenos ângulos (SAXS), ou a partir de estruturas de raios X de alta resolução.

Para proteínas e seus complexos, Rg e Rh estarão sempre na mesma ordem de magnitude, mas o que esses parâmetros de tamanho realmente significam para a caracterização de proteínas? 

Para responder a essa pergunta, precisamos olhar para três áreas-chave da caracterização de proteínas. Primeiramente, ser capaz de medir o tamanho oferece uma maneira simples de confirmar a identidade e o estado oligomérico de uma proteína em uma preparação, dado o conhecimento a priori do seu tamanho monomérico. Assim, é fácil ver como a triagem de tamanho pode ser implementada em laboratórios de produção de proteínas para identificar frações relevantes de proteína purificada ou verificar a consistência de formulações de lote para lote.

Segundo, os processos biológicos ocorrem em solução; portanto, o interesse em estudar e caracterizar proteínas está firmemente enraizado no entendimento e, em última análise, no controle do comportamento das proteínas. Acredita-se que, se alguém entender o comportamento da proteína em solução, então a interação com outras biomoléculas, drogas e entre si pode ser prevista. Essa informação pode então ser levada um passo adiante e usada para manipular soluções de proteínas com o objetivo de alcançar um resultado específico, por exemplo, desenvolvimento de formulações. Destarte, fica claro que Rh é um parâmetro biologicamente relevante, uma vez que considera o tamanho da proteína no contexto do seu ambiente.

Ambos Rg e Rh podem ser usados para obter insights sobre a terceira área-chave da caracterização de proteínas: estrutura. A maneira pela qual Rg é calculado significa que o valor em si é ligeiramente mais dependente da estrutura da molécula de interesse do que o valor de Rh. Mas é a razão entre Rg e Rh (Rg/Rh) que realmente fornece informações sobre a forma de uma molécula de proteína. O valor característico de Rg/Rh para uma proteína globular é ~0,775, o que significa que Rg é menor que Rh. No entanto, quando as moléculas desviam de globular para estruturas não esféricas ou alongadas, então Rg/Rh tende a valores superiores a 0,775, à medida que Rg se torna maior que Rh.

Experimentalmente, é importante lembrar que para proteínas Rg não pode ser obtido através de técnicas de espalhamento de luz estática e que Rh pode oferecer uma rota alternativa para informações de forma através da teoria de Perrin.

Em resumo, os valores de Rg e Rh não devem ser usados um no lugar do outro, mas cada um fornece uma perspectiva diferente sobre a proteína em questão. Além do valor das informações fornecidas pelo tamanho molecular, muitas características da medição em si precisarão ser consideradas, por exemplo, tempo de análise, concentração, volume de amostra, orçamento, a fim de estabelecer o valor real para o usuário.

Em breve…

Fique atento para a próxima parte desta série de blogs, na qual lançaremos luz sobre o ponto de agregação e como ele se relaciona com a estabilidade das proteínas e formulações biofarmacêuticas.