O Caminho para se Tornar um Mestre em Calorimetria Vol.8
Medindo RNase A com DSC! Parte 2

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Os personagens e a história aqui apresentados são fictícios.
Para conteúdos técnicos, recebemos a orientação do professor Fukada, pesquisador visitante na Universidade de Osaka.

No final da página, você pode baixar o “Procedimento de Análise do VP-DSC” mencionado no texto clicando no botão “Download”.

(Continuação da Parte 1

A linha de base da medição de controle está estável. Quando atingir cerca de 30°C, remova a tampa de pressão e preencha a amostra. Use o ThermoVac com Timer para desgaseificar a amostra. Após desgaseificar, remova a tampa de pressão e configure o plugue de pressão no sensor de pressão. Desta vez, sem usar o funil de enchimento, insira suavemente uma agulha conectada a uma seringa de tampa Luer na célula, sem bater no fundo, para remover o tampão da célula de amostra. Enchimento da amostra desgaseificada concluído. Após 15 minutos no Termostato de Pré-Varredura, Equilíbrio Final. O valor de DP está próximo de zero, então está OK!

Sr. Nakamura. Está indo bem?

	Sim, o valor de DP parece estar sem problemas. Agora é só aguardar os resultados da medição.

A propósito, você alterou o Número de Varreduras?

	Ah, eu esqueci. Mudar o número para 11 e clicar em Atualizar Parâmetros de Execução, certo? Foi por pouco.

	Mesmo depois de a medição ter começado, é possível, mas é preocupante se algo acontecer enquanto os dados estão sendo coletados.

Eu ficarei atento.

	Sr. Nakamura, conseguimos obter bons dados.

Obrigado. No entanto, a linha de base está subindo. O mesmo aconteceu com a medição de água-água. Isso não é um problema?

	Acredita-se que essa inclinação ocorra porque os volumes das células de amostra e de referência não são exatamente os mesmos. É um desvio do sistema que é inevitável. No entanto, no experimento de DSC, sempre se subtrai os dados de medição de controle dos dados de medição de amostra, então, se o desvio for semelhante, ele será compensado e não haverá problema.

Portanto, a qualidade dos dados depende da coincidência da inclinação da linha de base.

	Exatamente.

Se as inclinações não coincidirem, pode ser devido à incorporação de bolhas de ar na célula?

	É isso mesmo. Quando a reprodutibilidade da linha de base é ruim, devemos suspeitar primeiro das bolhas. A causa das bolhas pode estar relacionada à contaminação da célula.

	Tanto para ITC quanto para DSC, é muito importante manter as células limpas!

	Sim, manter as células limpas é extremamente importante. Além disso, se a composição do tampão varia, isso também pode levar ao desvio da linha de base, então tome cuidado.

	Mais um ponto. É importante que a resposta da amostra esteja abaixo da resposta do controle. Desta vez, também está assim.

Sim, está, mas por que isso acontece?

	Comparando o controle, ou seja, o tampão, e a solução de amostra, supõe-se que a amostra tem uma concentração molar de moléculas de água mais baixa, pois contém proteínas. A capacidade de calor da água é maior que a da proteína, então em amostras contendo mais água, mais calor será liberado.

Entendi. E se os resultados da amostra forem maiores?

	Pode ser devido a uma leve diferença na composição do tampão.

	Agora vou limpar o sistema e desligá-lo.

Bom trabalho. Vamos para a análise.

	Sim, vou seguir o manual por enquanto.

Oh, não tenho esse ícone na área de trabalho…

	Dependendo do momento da sua compra, pode haver um sistema com MicroCal Analysis Launcher no desktop em vez do ícone MicroCal, LLC DSC. Para esses casos, clique duas vezes neste ícone, e no MicroCal Data Analysis Click button to Start, escolha o VP-DSC. As operações seguintes seguem o manual.

Então, tenho 10 varreduras de dados de controle, mas qual devo escolher? Normalmente, o mais próximo da medição de amostra, certo?

Sr. Nakamura, como está indo?

Tenho 10 varreduras de controle, mas devo usar o 10º que está mais próximo da amostra?

Sim, repetições melhoram a reprodutibilidade, então use o 10º desta vez. Mas se houver ruído de espigão nos dados no controle final, você deve escolher a anterior.

	Entendi, obrigado. Chamarei o 11º para amostra e o 10º para controle.
	Nota: O software de análise exibe como Kcal/mole, mas a forma correta é kcal/mol.

Sr. Nakamura, parece que a análise está boa também.

Mas há dois valores de ΔH. Qual devo adotar?

Sr. Nakamura, você já perguntou isso, se não me engano?

???

A diferença entre a mudança de entalpia calorimétrica (ΔHcal) e a mudança de entalpia de van’t Hoff (ΔHvh).

	Ah, esqueci!

Aquele com v de ΔH é a mudança de entalpia de van’t Hoff. Nesta vez, os valores são semelhantes, indicando que a RNase A é uma proteína de transição de 2 estados.

Exatamente. Para esse tipo de amostra, o modelo de 2-Estados pode ser utilizado para análise.

	Aliás, professor, no Kit de Teste está especificado “método de análise de dados: Integrar a partir de 0”, o que isso significa?

O software de análise tem uma função que permite encontrar a mudança de entalpia e Tm com base nas informações de pico após subtrair a linha de base.

	Complementando, “Integrate from 0” não está no manual simplificado em japonês. Ao editar dados após fitting, a subtração da linha de base até o fitting é comum. As etapas posteriores são as seguintes:

Oh!? Tm e NDH diferem dos valores obtidos pelo fitting!

	O Tm da “Integrate from 0” procura o topo do pico, enquanto o fitting calcula a temperatura do ponto médio da área do pico obtida. Além disso, NDH na “Integrate from 0” é a área real, mas no fitting é a área calculada (linha vermelha), o que causa diferenças. Graficamente, há desvio entre o valor medido e a curva de fitting, não?

Sim. Qual é a faixa aceitável para esse desvio?

Na última visita a Malvern, foi informado que SE dentro de 2% é aceitável.

Com ΔH de 1.026E5 cal/mol (1.02 kcal/mol), 2% é 2052 cal/mol, então 409 cal/mol está dentro do limite aceitável.

É isso mesmo.

Complementando, em uma pergunta anterior do Sr. Nakamura, pode-se optar por obter os parâmetros por fitting ou não. Amostras de 2 estados, geralmente, resultarão em valores semelhantes entre “Integrate from 0” e fittings, pois os picos são simétricos. Em não-2 estados, os picos podem não ser simétricos. O importante é usar o mesmo método para todas as análises.

Clique no botão “Download” abaixo para baixar o “Procedimento de Análise de Dados do VP-DSC” mencionado.
(É o mesmo disponível na Parte 1).

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