O Caminho para se Tornar um Mestre em Calorimetria Vol.2 Continuação
Vamos Usar o Calorímetro de Titulação Isotérmica iTC200!
※No final deste artigo, você poderá baixar os materiais.
Finalmente, o Sr. Nakamura visitou o escritório do professor Fukada.
Professor Fukada! Já faz tempo!! Como você está?
Sr. Nakamura, que bom que veio. Tenho esperado por você. Quanto tempo faz? Hehe. Ouvi dizer que vai usar o ITC e DSC.
Sim, é verdade! Agradeço desde já. Eu sabia que você usava essa técnica quando eu era estudante, mas nunca pensei que iria acontecer comigo.
Hehe. O mundo dá voltas. Então, por onde vamos começar?
Eu estava tentando fazer medições com o iTC na empresa, mas não obtive sucesso… por isso, preparei algumas perguntas.
Oh, você está bem preparado. Vamos dar uma olhada.
O professor Fukada revisou as anotações do Sr. Nakamura.
Sr. Nakamura. Talvez você tenha ficado um bom tempo sem usar o sistema?
Se DP estiver alto e o ruído da linha de base aumentar, isso é um sinal.
Trocar a água da célula de referência não resolveu, certo?
É bom fazer uma limpeza intensiva.
Limpar é crucial.
Eu lavo a célula e a seringa com detergente e água ultrapura após cada medição.
A razão para DP estar mais alto do que o reference Powder não é por bolhas,
Provavelmente sim. Limpe a célula com 20% Contrad 70 ou 14% Decon 90 enquanto aquece. Está no manual.
Ah, isso mesmo! (Manual P41 e (Nota 1))
(Nota 1) Para quem usa VP-ITC, consulte o manual P.45. Para mudar a temperatura do jacket, insira a temperatura em Set Point (℃) na aba Thermstat/Calib. e clique em Set Jacket Temp.
Se o DP estiver baixo, provavelmente é porque há bolhas na célula da amostra. Como evitar bolhas?
Ao injetar a solução, pegue um pouco mais (350 μL) com a seringa e coloque a agulha o mais perto possível do fundo para inserir devagar. Na maioria dos casos, isso resolve, mas para pequenas quantidades de solução, digamos, em torno de 50 μL, faça a circulação interna para expulsar bolhas.
O volume do duto até a célula é de cerca de 50 μL, então, se você ultrapassar esse valor ao bombear, corre o risco de reinserir bolhas na célula, mesmo que as tenha acabado de tirar.
Além disso, balançar a seringa dentro da célula pode ajudar a liberar as bolhas presas entre a célula e o duto.
Um detalhe importante: se a temperatura da solução for menor que a de medição, aqueça-a previamente até se aproximar da temperatura de medição. Segundo o fabricante, para o iTC200, não é necessário desgaseificar a solução (Nota 2).
Com o tempo, você pegará o jeito do processo, então persista.
(Nota 2) Para quem usa VP-ITC, é necessário desgaseificar antes de medir.
Quanto à referência, por que é aceitável usar água ultrapura? Em experimentos, geralmente, o buffer é harmonizado, certo?
A célula de referência deve anular as variações térmicas externas com uma solução de mesma capacidade térmica que a célula da amostra. A capacidade térmica da água é alta e, na solução, a água é o principal componente. Por isso, água sem buffer já é suficiente.
Troque a água da referência semanalmente, mas se continuar a medir em alta temperatura, troque por cada medição.
Entendo, obrigado pela explicação.
Professor, posso fazer só mais uma pergunta?
Claro, pergunte o que quiser.
Obrigada! Sobre a concentração ao medir amostras, o manual menciona C como critério, mas não entendi muito bem.
Adjunta explicação: C define a concentração da amostra celular para obtermos uma curva sigmoid ótima na análise.
O iTC200 vem com um software de simulação, então as configurações de medição são fáceis de definir.Em geral, a concentração de proteína usada é de cerca de 10 μM, mas varia segundo a força de ligação.
Se usarmos o critério de valor C, a concentração celular em interações de alta afinidade será muito baixa.
Por exemplo, para uma amostra com constante de dissociação de 10 nM, se tentarmos manter o valor C em 5, 
50 nM seria a concentração calculada para a célula,
mas a medição nessa concentração pode não resultar em calor suficiente, por isso 1 μM (Nota 3) é recomendado como concentração mínima.
Informação precisa sobre concentrações é crucial no ITC, mas por ora, use espectrômetros UV para determinar a concentração de proteínas a 280 nm.
Vamos fazer medições. Primeiro, vamos usar CaCl2 e EDTA como prática.
(Nota 3) O calor gerado a partir de interações varia. Às vezes, 1 μM é suficiente, mas com trocas menores, aumente a concentração celular.
A próxima fase incluirá a análise dos dados reais, dicas para leitura de dados e solução de problemas.
Fique atento!
Para tornar este blog mais realista, realizei uma entrevista enquanto observava o professor Fukada fazer uma medição ITC.
O sistema em uso, vendido pela primeira vez em 1987, era o OMEGA. Fiquei surpreso ao ver que quase 30 anos depois ele ainda funcionava. Foi a primeira vez que vi o sistema funcionando. O computador que usavam era Windows 3.1 !? Claro que sem porta USB. Mas o mais surpreendente foi saber que a célula do sistema nunca havia sido danificada e apenas o motor agitador e a placa do PC precisaram de reparos.
O professor Fukada tinha uma compreensão tão profunda do sistema que criou métodos próprios, não encontrados no manual. E claro, ele era muito rigoroso com a limpeza pós-medição.
Compartilharei mais insights daqui para frente.
A história do MicroCal ITC está no blog da Malvern no Reino Unido. Veja aqui!
