Caminho Para o Mestre do Calorímetro Vol.4

Vamos fazer a medição de proteínas e compostos. Não sabemos a afinidade por enquanto, então vamos medir com proteína a 10 μM e composto a 100 μM pelo método usual.

Não está traçando uma curva sigmoide. Talvez eu tenha configurado a concentração erradamente… O calor de diluição do controle é quase o mesmo em cada titulação. O valor de DP é 0.015 μcal/seg, então é pequeno. Além disso, é menor que o calor da última titulação da amostra, o que significa que a quantidade de calor gerada pela amostra é muito pequena. Pergunto-me se é bom apenas subtraí-lo…

Nakamura-san, parece que está tendo problemas.

Professor Fukada, sim, estou. Fiz a medição de proteína e composto, mas não está traçando uma curva sigmoide e parece que a quantidade de calor obtida é muito pequena.

Parece que sim. Nakamura-san, você já tentou usar o software de simulação antes das medições?

Ah, é o que vem com o software de controle do iTC200, não é? Desculpe, não usei…

Está no manual. Que tal dar uma olhada na página 39?

Sim, vou verificar.

Além disso, parece que a afinidade da amostra medida desta vez é relativamente fraca.

Sim, creio que seja cerca de alguns μM.

Como configurou as concentrações?

Fiz com proteína a 10 μM e o composto a 100 μM.

Então, que tal simular assumindo K_D de 5 μM?

Ah, está traçando uma sigmoide. Mas ficou com uma concentração mais alta do que usei.

Isso mesmo. Essa é a concentração medida recomendada pelo software de simulação. Então, o que acontece se simular com a concentração que Nakamura-san usou?

Com proteína a 10 μM e composto a 100 μM…

Oh! Não está traçando uma curva sigmoide!!

Sim. No caso de saber previamente a K_D esperada, é uma boa ideia simular e confirmar antes da medição real.

Entendo. O software de simulação é útil!

Agora, uma pergunta. Estes são dados de ITC medindo Anidrase Carbônica Bovina interagindo com pequenas moléculas Sulfanilimida e AMBSA. O que acha dos dados?

A figura da Sulfanilimida parece traçar uma curva sigmoide, mas a da AMBSA parece linear, sem gerar uma sigmoide claramente.

Sim. Como acredita que podemos fazer com que traçem uma curva sigmoide?

Hum… da última vez, quando reduzi a concentração, a sigmoide não foi traçada, então aumentá-la ajudaria?

Isso mesmo. Por sinal, acredita-se que a K_D da Sulfanilimida é cerca de 8 μM e a da AMBSA é 10 μM.

Simular seria uma boa ideia.

Com as concentrações do gráfico anterior, não era possível traçar uma curva sigmoide adequada. Mas professor, no resultado da simulação, a concentração da célula está configurada relativamente alta. O que fazer se essa concentração não puder ser preparada?

Nakamura-san, lembra do alcance de configuração dos valores de C?

Alcance de configuração?

Verifique no manual. Em qual faixa seria ideal ter os valores?

Ah! Idealmente entre 5 e 250, com 1 a 1000 sendo aceitável. (Consulte o Manual Simplificado em Japonês P.7-8)

Certo. O software de simulação permite alterar valores de C. Você também pode simular o que aconteceria ao medir com a concentração real da amostra preparada.

Entendi! Trata-se de design experimental.

Exatamente. Agora, Nakamura-san, você pode precisar medir compostos com afinidade ainda mais baixa. Vou compartilhar dicas para medição e análise para isso.

Sim! Por favor, me ensine!

O que acha deste dado, Nakamura-san? É a interação entre uma proteína e um fragmento…

Não está traçando uma sigmoide, então aumentar a concentração para uma nova medição, talvez?

Se este experimento foi medido com proteína em 30 μM e fragmento em 3 mM, o que acontece?

O quê? A concentração do fragmento é tão alta? E a da proteína na célula não é tão alta assim…

Vamos voltar ao manual. Consulte P.9. sobre montar um sistema experimental para afinidades mais fracas que 100 μM.

Não está criando uma sigmoide.

Sim, e em casos de afinidade muito fraca, pode-se dificultar a criação da curva sigmoide devido à configuração de concentração. Que tal simular isso?

Uau! Não posso medir proteína a 1 mM!!

Sim, casos assim exigem configurar a proteína na faixa 1/5 a 1/100 do K_D previsto, garantindo 10 μM, e ajustar o titulado a 10-50 vezes K_D, vários mM, de modo que o titulado sature completamente no final. Veja o eixo x do gráfico de proporção molar dos dados normalizados anteriores. Está alto, não?

Sim. Mesmo assim, não se parece uma sigmoide…

Correto. Neste estado, não se pode determinar a razão de ligação ou alteração de entalpia. Ajustes são necessários na análise.

Ajustes?

Sim, ao assumi-la “fixa” para análise. Se a medição indica 1:1, pode assumi-la “1”. Simulações"fixas" assumem que a sigmoide corresponde ao ponto de inflexão, ajusta-se inicializando “1” como constante, omitindo-se “Vary?”. Isso permite estimar K_D e ΔH.

É isso! Mas lembre-se, espera-se que as amostras sejam 100% ativas.

Sim!

Assim, Nakamura-san pode medir amostras reais, aprendendo as propriedades, medições, condições, e métodos de análise apropriados. Ao encontrar reações irregulares, tente descobrir por quê, em vez de forçar a análise. O próximo tratará interpretações e abordagens para dados irregulares.

【Nota do Blog】
Pergunta comum sobre ITC? “Solução não flui ao lavar seringa de titulação”. A solução está no Caminho Para o Mestre do Calorímetro Vol.2.

Desgaste, conecta](O-ring, etc.), mas novo problema: filtro entupido no Washing Module.

Trocar o filtro pode resolver problemas não sanados por “Método para quando a água não flui pelo MicroCal iTC200”. Filtros vêm com o sistema.

Dependendo do período de entrega, o filtro pode estar dentro, invisível. Nesse caso, entre em contato conosco para assistência.