A medição confiável da cinética de ligação dos analitos de baixo peso molecular aos seus alvos continua sendo uma tarefa desafiadora. Muitas vezes, a introdução de rótulos é simplesmente impossível nessas medições, e a aplicação de métodos sem rótulo é a única opção confiável.
Medindo a cinética de ligação dos íons Ni(II) de acordo com as camadas de flagelina geneticamente modificadas, demonstramos que: (1) A Interferometria acoplada a grade (GCI) é adequada para resolver a ligação de íons, mesmo com níveis de imobilização proteica muito baixos; (2) fornece dados cinéticos de alta qualidade a partir dos quais o número e a força dos locais de ligação disponíveis podem ser determinados e (3) as constantes da taxa dos eventos de ligação também podem ser obtidas com alta precisão. Os experimentos foram realizados utilizando-se uma variante de flagelina que incorpora o domínio C-terminal do fator de transcrição niquelado-responsivo NikR.
Os resultados do GCI foram comparados com os dados de afinidade da calorimetria de titulação. Verificamos que, além dos locais de ligação de baixa afinidade caracterizados por uma constante de dissociação micromolar (Kd), as moléculas tetraméricas FliC-NikRC possuem locais de ligação de alta afinidade com valores Kd na faixa nanomolar. A GCI nos permitiu obter dados cinéticos em tempo real para a ligação específica de um analito com massa molar de 59 Da, mesmo em sinais menores que 1 pg/mm2.
A medição confiável da cinética de ligação dos analitos de baixo peso molecular aos seus alvos continua sendo uma tarefa desafiadora. Muitas vezes, a introdução de rótulos é simplesmente impossível nessas medições, e a aplicação de métodos sem rótulo é a única opção confiável.
Medindo a cinética de ligação dos íons Ni(II) de acordo com as camadas de flagelina geneticamente modificadas, demonstramos que: (1) A Interferometria acoplada a grade (GCI) é adequada para resolver a ligação de íons, mesmo com níveis de imobilização proteica muito baixos; (2) fornece dados cinéticos de alta qualidade a partir dos quais o número e a força dos locais de ligação disponíveis podem ser determinados e (3) as constantes da taxa dos eventos de ligação também podem ser obtidas com alta precisão. Os experimentos foram realizados utilizando-se uma variante de flagelina que incorpora o domínio C-terminal do fator de transcrição niquelado-responsivo NikR.
Os resultados do GCI foram comparados com os dados de afinidade da calorimetria de titulação. Verificamos que, além dos locais de ligação de baixa afinidade caracterizados por uma constante de dissociação micromolar (Kd), as moléculas tetraméricas FliC-NikRC possuem locais de ligação de alta afinidade com valores Kd na faixa nanomolar. A GCI nos permitiu obter dados cinéticos em tempo real para a ligação específica de um analito com massa molar de 59 Da, mesmo em sinais menores que 1 pg/mm2.
