Método da Barreira de Difusão – detalhes práticos

Como realizar a medição do potencial zeta com o método da barreira de difusão?

O método da barreira de difusão é especialmente adequado para pequenos volumes de amostra e tampões com alta força iônica. O método consiste em injetar cuidadosamente um “plug” da amostra em uma célula capilar dobrada que já contém apenas o tampão. (O tampão deve ser o mesmo da preparação da proteína, mesma condutividade, mesmo pH e mesmos aditivos, a fim de igualar a amostra e a barreira de difusão o mais precisamente possível). Neste setup, o potencial zeta é de maior interesse, embora o tamanho também possa ser determinado.

Os detalhes práticos são discutidos em “The Diffusion Barrier Technique, Practical Aspects and Data interpretation”, na gravação da apresentação na web “Protein zeta potential measurements using Malvern’s new diffusion barrier method”, bem como na nota de aplicação “The Diffusion Barrier Technique for Accurate and Reproducible Protein Mobility Measurement“.  Abaixo está um breve resumo sobre a visão prática dos componentes-chave deste método.

Por que considerar este método de barreira de difusão?

Existem duas razões principais para você considerar este método. Ambas estão relacionadas à amostra.

1. Baixa disponibilidade de amostra. Se você tiver uma quantidade muito limitada de amostra, então este método permite uma medição mesmo que apenas parte da célula contenha amostra. (E o restante da célula contém tampão).
2. Proteger a amostra de interações com eletrodos. Em algumas condições (ex.: alta força iônica, alguns sais de fosfato, componentes de tampão contendo enxofre) pode ocorrer escurecimento do eletrodo (degradação). Embora o escurecimento em si não seja necessariamente ruim, é uma indicação de possíveis interações entre amostra e eletrodo.

Outros efeitos incluem aquecimento por Joule, degradação da amostra (agregação) e polarização do eletrodo. O uso do método da barreira de difusão pode ajudar a minimizar esses efeitos adversos.

Como introduzir a amostra?

A amostra é suavemente injetada na célula capilar DTS1070 preenchida com tampão com uma ponta de carregamento de gel. Testamos as pontas de pipeta Costar (1-200µl, redondas, 0.5mm de espessura, Sigma cat:4853) e similares devem funcionar bem. Para usá-las, insira suavemente a ponta de carregamento de gel por um dos portos de carregamento na célula capilar até sentir um “fim natural”, então injete 70µl inicialmente (você nunca errará com a localização do plug neste caso). À medida que se familiarizar mais com o método, é fácil reduzir o volume de injeção para 50µl, e eventualmente até 20µl. Você pode praticar isso com uma solução de azul de dextrano, ou usando o monitor de taxa de contagem no software (Ferramentas – Medidor de Taxa de Contagem) para confirmar que o volume de dispersão está dentro do plug da amostra.

Quais configurações no software?

Você deve selecionar configurações especiais no instrumento para poder medir o potencial zeta de amostras de proteína em tampões com forças iônicas relativamente altas. O modo automático no software de análise de zeta reduzirá a voltagem aplicada. Mas para o manuseio mais delicado de amostras sensíveis, você pode ajustar manualmente as configurações de análise de acordo com a tabela abaixo, retirada da nota de aplicação.

Para acessar as configurações durante a configuração Manual ou SOP vá para:

• Medição -> Duração da Medição -> Automático -> Número máximo de execuções
  Mantenha o mínimo em 10 e selecione o máximo de acordo com a tabela
• Medição -> Medições -> Atraso entre medições (segundos)
  Ao repetir medições, é uma boa ideia deixar a amostra descansar por 30 segundos
• Medição -> Avançado -> Voltagem -> Seleção Automática de Voltagem -> Não
  Insira a voltagem sugerida de acordo com a tabela

Anteriormente

• Obtenha o software Zetasizer DTS mais recente (download gratuito)
• Titulações complexas – dosagem variável (zeta e tamanho)
• Dicas e truques para caracterização de nanopartículas (44 perguntas e respostas)
• Blog de lançamento inicial sobre o método da barreira de difusão

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