O Caminho para o Mestre do Calorímetro Vol.3 Pontos-chave sobre Medição e Análise com Calorímetro de Titulação Isotérmica iTC!

Bem, eu mantenho o meu sempre ligado. Dá mais estabilidade ao sistema. Mas cada laboratório pode ter suas próprias regras; talvez seja uma boa prática ajustar a temperatura pelo menos um dia antes, ou uma hora antes, para estabilizar a linha de base. Para garantir uma linha de base estável, é melhor ligar o sistema com antecedência. E, claro, não se esqueça de ajustar a temperatura de medição!

Entendi. Próximo passo, é hora de trocar a água ultra-pura de referência. Esse procedimento deve ser feito uma vez por semana, certo? Se não formos usar o sistema por mais de uma semana, ainda precisamos fazer isso?

Se não for usá-lo, não há necessidade de trocar. Mas, mesmo com a água, algo pode crescer se deixado muito tempo, então mude a água ultra-pura em ambas as células, a amostra e a referência, pelo menos uma vez por mês. Uma dica importante: certifique-se de terminar a medição com água ultra-pura e fresca em todas as células. Se as células secarem com resíduos, eles podem ficar incrustados.

Ok! Agora para a limpeza do sistema. De acordo com o manual, usamos o comando do software de controle, certo? Selecionar Cell and Syringe Wash guia na tela. Siga as instruções dadas por lá.

Exatamente. Não haverá problemas se seguir as instruções. Mas, se quiser fazer uma limpeza mais minuciosa, você pode usar outros comandos conforme necessário. O significado de cada comando está no manual, então confira lá.

Na página 42 do manual.

Se precisar de um manual, entre em contato.

Eu, pessoalmente, lavo as células após cada medição com detergentes, especificamente 14% Decon90 ou 20% Contrad 70. Após remover a amostra medida, enxáguo com água ultra-pura usando uma seringa hermética. Depois disso, preencho com detergente usando a mesma seringa. Atenção, os detergentes geram espuma rapidamente. Se parecer sujo, deixo o detergente agir por alguns minutos. Quando retiro o detergente, faço o Cell Water Rinse (Long) várias vezes para garantir que não restem traços do detergente. Manter a célula limpa é essencial para obter dados de boa qualidade.

Entendi. E sobre a limpeza das seringas, há alguma atenção especial?

Após a etapa de secagem na limpeza convencional, cheque visualmente se há gotas de água na parte de vidro da seringa ou no local limpo. Se ainda houver gotículas, a secagem pode estar incompleta, e existe o risco de metanol no sample da seringa. Por exemplo, durante uma medição água-água, se houver uma reação exotérmica visível, pode significar contaminação por metanol, geralmente causada por uma má instalação do adaptador Fill Port.

Estou um pouco preocupado com este adaptador Fill Port até me habituar com ele.

Pode ser que sim, mas após dois ou três usos, você se acostumará! Além disso, se os testes apresentarem reações térmicas mesmo sem resíduos de metanol, a seringa pode estar suja. Há instruções no manual sobre isso, então siga-as ao usar detergentes.

Na página 42. A secagem da seringa parece ter terminado, então vou carregar a amostra. Sem gotas. As amostras precisam estar à temperatura ambiente para evitar bolhas, certo? Se já houver bolhas, é melhor degasificar?

Com o iTC200, dizem que a degasificação não é necessária. Bem, a exceção é se houver bolhas visíveis. Girar levemente a amostra à temperatura ambiente deve resolver.

Entendi, é preciso um pouco de habilidade. Agora vou colocar EDTA na célula da amostra e CaCl₂ na seringa de titulação. Não há bolhas entre a solução e a ponta do êmbolo! Parâmetros configurados. Pronto para começar! Ao estabilizar o DP, a titulação começa.

Sim, vamos observar.

O Sr. Nakamura lembrou-se de configurar a temperatura do casaco de calor dessa vez, então a seringa começou a rodar rapidamente. Se a temperatura de medição e a temperatura real diferirem muito, a rotação da seringa não inicia imediatamente.

Professor, o sistema determina quando a linha de base está estável, mas no manual consta que pode ser feito manualmente…

Os critérios do software para estabilidade da linha de base podem ocasionalmente iniciar medições com algum desvio. O iTC200 tem um bom ratio S/N, então o desvio pode não afetar muito o resultado. Mas é importante entender por que a linha de base é instável.

Isso tem a ver com influências externas de sistemas como ar-condicionado, certo?

Exatamente. Também pode ser por campos magnéticos próximos. Influências de ar-condicionado e campos magnéticos podem causar drifts regulares. Bolhas no interior das células também provocam drifts, seja desde o início ou devido a uma célula suja que gera bolhas. Bolhas na célula de amostra podem ser expulsas pela seringa de titulação, o que resulta em um aumento da linha de base de padrão crescente. Ou pode haver uma subida repentina na linha de base quando saem as bolhas.

Então, o DP no início da medição deveria estar dentro de ±1 µcal/sec do valor definido, não?

Sim, mas ±1 µcal/sec é um critério um tanto frouxo… O importante é estar próximo do valor definido. Será que a linha de base já está estável?

Sim, está estável em torno de 9.7 µcal/sec. A medição começou, leva cerca de uma hora, certo? Pausa?

Espere, Nakamura. Não é prudente se afastar antes da segunda titulação terminar.

O quê!? Você segura firmemente até a segunda titulação.

Primeiro verifique o DP da linha de base. Agora temos dois checkpoints a seguir.

Galeria e ponte os dois checkpoints.

Primeiro, verifica-se se o poder de referência é adequado. Foco em interações biomoleculares, 5 µcal/sec são suffisientes. Aqui com EDTA e CaCl₂, definimos 10 µcal/sec. A primeira titulação é menor para garantir consistência de concentração.

Nota: No ajuste de parámetro titulação, o primeiro é 1/5 do volume principal. Porque a concentração na interface da seringa dilui ao equilibrar, recomenda-se na MicroCal ITC que o primeiro não seja usado na análise. Com biomoléculas, a energia da titulação inicial deveria geralmente cair dentro de -1 µcal/sec. Excesso de potência de referência pode induzir ruído sem necessidade, embora a medição não seja afetada, mas esteja ciente da interferência.

A referência de potência indica a energia que podemos medir. Neste caso é 10 µcal/sec. A falta de potência de referência significa que ultrapassam os rangos do Y zero. A calibração precisa ser corrigida ou repetida, não alterada a referência.

Podemos mudar a potência referente no meio?

Infelizmente, é impossivel. Apenas Injection Parameter pode ser ajustado durante a medição.

Mesmo corrigindo a potencia de referencia, a inconsistência de concentração exige realizar nova medição ou trata-lá apenas como informação de referência.

Entendi. O primeiro passo é observar o primeiro gotejamento controlado para validar parâmetros antes da segunda titulação.

Verifique se há espaçamento suficiente. A resposta de cada titulação deve retornar à linha de base. Caso contrário, o pico da área e, portanto, a energia de reação não são medidos corretamente.

Continua…