Caminho para se tornar um Mestre em Calorímetro Vol.4
Aprimore suas habilidades para otimizar experimentos de ITC!
Os personagens e histórias apresentados aqui são fictícios.
Para os conteúdos técnicos, recebemos aconselhamento do Professor Fukada, pesquisador visitante da Universidade Prefeiturada de Osaka.
※ No final deste artigo, você poderá baixar materiais.
【História anterior】
O Sr. Nakamura da Maruban Seiyaku foi encarregado pelo seu superior Sr. Tanaka para iniciar o calorímetro. Sob a orientação do Professor Fukada, ele conseguiu adquirir as noções básicas de medição e análise da iTC200.
【História de hoje】
Após adquirir as habilidades básicas, o Sr. Nakamura decidiu realizar medições de um anticorpo-antígeno em mãos. O antígeno é uma proteína com peso molecular de aproximadamente 50 kDa, adquirida comercialmente, enquanto o anticorpo foi preparado por ele mesmo. A afinidade prevê-se que seja da ordem de alguns nM a partir de outros resultados de medição.
Pelos artigos, parece que geralmente colocam o anticorpo na célula e o antígeno na seringa. Calculando a partir do valor C(＊1), como o KD é da ordem de alguns nM, a concentração é muito baixa, portanto era necessário garantir pelo menos 10 μM, certo? Para ligação 1:1, seriam necessários 100 μM de antígeno, mas como o anticorpo é bivalente, seriam necessários 200 μM de antígeno, certo? Mesmo que o anticorpo seja 5 μM e o antígeno 100 μM, será que está OK? Como quero economizar amostras, farei com concentrações mais baixas. Primeiro, farei o experimento de controle (＊2). Sobre volume e número de gotas, farei conforme as condições na página 9 do manual simplificado em japonês, ou seja, 18 gotas de 2 µl cada. No entanto, a primeira gota será de 0,4µl.
※1 Para mais informações sobre o valor C, consulte Caminho para se tornar um Mestre em Calorímetro Vol.2.
※2 Para mais informações sobre o experimento de controle, consulte Caminho para se tornar um Mestre em Calorímetro Vol.3.
Acho que o calor de diluição está grande? Será que é normal? De qualquer forma, vou medir a amostra.
Sem grande diferença em relação ao experimento de controle?! Mesmo o calor no final da medição não converge para zero… e o tampão utilizado deveria ser da mesma composição, então não pode ser um erro de tamponamento… Será que a seringa está suja? Não, fizemos uma verificação do sistema antes da medição, então não é possível. Professor Fukada～.
Nakamura, qual é o problema?
Na verdade, minha amostra é um anticorpo e um antígeno, mas quando fizemos a medição, praticamente não havia diferença entre os dois dados.
Meu Deus, realmente. Não dá para saber o que estamos medindo assim. Já investigou a causa?
O valor DP configurado com o Power de Referência em 5 μcal/sec está correto, então não acho que seja a limpeza da célula. Pensei que poderia haver um problema com a resposta de titulação por possível sujeira na seringa, mas realizamos uma verificação do sistema antes da medição da amostra e estava tudo bem. Portanto, achei que poderia ser um erro de tamponamento, mas estou usando o mesmo tampão utilizado na purificação de gel do anticorpo, com mesma composição para o antígeno. Então não acho que seja isso.
Disse “Estou usando o mesmo tampão.” Você não fez diálise no seu antígeno?
Sim. Desta vez, preparei o anticorpo pessoalmente, mas para o antígeno usei uma amostra Carrier Free comprada pronta, diluída no mesmo tampão usado para o anticorpo purificado em gel de filtração.
Então não fez a diálise após a purificação por gel! E o antígeno foi diluído no tampão de gel filtrado?
Strictamente falando, para ajustar a concentração do antígeno, usei algo preparado separadamente, mas a composição deve ser a mesma.
Nakamura, provavelmente a composição do tampão ficou diferente no final. Mesmo que diga que é a mesma composição, sempre haverá uma pequena diferença ao medir os reagentes. Mesmo coisas preparadas no mesmo dia podem mudar ligeiramente no dia seguinte. E você usou um material Carrier Free liofilizado, certo? Verificou as condições durante a formulação? Algumas vezes, TFA e acetonitrilo são usados e podem permanecer como componentes residuais, o que afetaria o pH e outros fatores.
Sério?!
Se precisar alinhar perfeitamente a composição do tampão da amostra e da seringa, a diálise é essencial. Especialmente para materiais comprados prontos, é melhor fazer diálise em conjunto com o anticorpo para eliminar fatores incertos.
Entendi. Vou fazer a diálise e tentar novamente. ITC é tão sensível…
Só para complementar, é extremamente importante “combinar precisamente a composição do tampão da célula e da seringa” na medição de ITC. Se, no experimento de controle, houver uma grande reação de calor ou variação na reação durante a titulação, isso pode indicar incompatibilidade entre a solução de ligando e o tampão. Além disso, se a secagem do metanol na seringa não for suficiente, isso deve ser notado.
Antes de prosseguir, verifique o casamento do tampão. Se, mesmo verificando atentamente, não puder eliminar as tendências notadas no experimento de controle, há a possibilidade de agregação do ligando dentro da seringa. Nesse caso, é necessário revisar as condições de medição.
Já para ligandos de baixo peso molecular que não podem ser dialisados, pode-se preparar dissolvendo o ligando na solução de diálise do polímero após a diálise. No entanto, preste atenção ao usar amostras contendo aditivos, sais e outros componentes residuais. Após a dissolução, cheque o pH com um medidor. Se o pH do ligando distar 0,05 ou mais do pH do tampão, ajuste com quantidades mínimas de solução de HCl ou NaOH. Alterações de calor causadas por pequenas diferenças de concentração de sal podem ser subtraídas pelo experimento de controle.
Além disso, ao usar ligandos de baixo peso molecular com grupos protônicos, se medido em condição onde o tampão tem pequena diferença de concentração em relação à dos ligandos, o pH pode não ser adequadamente tamponado, afetando-o.
No dia seguinte….
Diálise finalizada. Concentrações ajustadas! Nenhuma divergência de pH. Posicionei a amostra e medi!!
O calor de diluição no experimento de controle está estável. No final, a medição da amostra converge para o calor de diluição! Diálise é importante! Agora, para a análise.
O ajuste ficou bom! KD está em 6nM com uma proporção de ligação de 1,8.
Nakamura, você fez um bom trabalho coletando bons dados.
Sim. Aprendi o quanto a diálise é essencial!
É verdade. Mas me diga, como você subtraiu os dados de controle desta vez?
Segui o manual, subtraindo os dados brutos.
Isso mesmo.
Como dica adicional, o manual recomenda subtrair com os dados brutos no controle. Quando o calor de diluição é constante, se houver muito ruído, talvez seja melhor subtrair o valor médio. Escolha de acordo com o caso.
Então uma pergunta: Esta figura é de dados após subtração do controle, mas tem um problema para a análise. Você consegue identificar onde está?
O ajuste está ruim?
Correto. Por que acha que o ajuste está ruim?
Será que o modelo está incorreto, talvez?
Não acho que seja um erro de modelo. Pode identificar qual parte do ajuste está especialmente ruim?
Provavelmente onde o gráfico está se tornando um platô durante a medição?
Exato. Mas por que você acha que isso ocorre?
…Não sei.
Na análise, o software calcula para que o calor no final da medição convirja para zero. Observando este gráfico, os dados de medição aparecem acima de zero. Mas a linha de ajuste vermelha está convergindo para zero no final.
Ah, veja só! Isso mesmo!
Então, Nakamura, por que, mesmo após a subtração do controle, os dados da medição não convergem para zero?
Porque há uma diferença no calor de diluição entre a medição do controle e da amostra, resultando em um valor positivo após a subtração?
Exatamente. Então, como você acha que deveria proceder em uma situação como essa?
Hmm, não sei.
Quando for difícil subtrair completamente o calor de diluição, às vezes ajustamos a curva sigmóide para que as leituras finais se tornem zero, editando os dados para a análise.
Um ajuste mestre?! Como seria isso?
O recurso Y Translate pode ser muito útil.
Y Translate?
Literalmente, uma ferramenta para mover valores no eixo Y. Siga as instruções nos materiais.
Para mais informações sobre o uso do Y Translate, preencha o formulário no final do artigo e faça o download dos materiais.
Muito obrigado.
Estou começando a me familiarizar com o software de análise… Não tem um manual mais detalhado?
Sim, existe. Você pode baixar um PDF no site da Malvern (em inglês). (É necessário se registrar no site da Malvern).
Fornecemos exemplos específicos de análise, e todos os dados estão salvos no PC fornecido com o produto.
Também explicamos as equações de ajuste usadas na análise, então, por favor, consulte os materiais.
Terminei o Y Translate. Será que o ajuste ficou bom?
A diferença entre o ajuste e os dados de plotagem do final da titulação diminuiu!
Nakamura, você entendeu um pouco mais, certo?
Sim!
Outro ponto, qual tampão você escolheu para esta medição?
Usei tampão de fosfato, tal como usado na preparação do anticorpo, também no ITC.
Interessante. Então, você acha que obteria os mesmos dados usando tampões diferentes, mas com o mesmo pH?
O que?!
Por exemplo, e se fosse utilizar HEPES ou Tris com pH igual ao do fosfato?
Hmmm, sei que em experimentos mudar tampões pode alterar resultados, então deve ter alguma diferença…
Exato. Há uma dica disso no manual simplificado em japonês.
Sério?
Confira a composição dos tampões na página 5.
Ah, entendi. Há diferença na entalpia de protonação entre os tampões. Mas quão diferente pode ser?
Agora que a medição está encerrada, que tal tomarmos um chá e conversar? (Para mais detalhes, veja Coluna do Dr. Fukada 3).
Sim, Professor Fukada! Obrigado!!
