Ampliar os limites na descoberta de hits farmacêuticos com o novo ensaio cinético waveRAPID

Resumo

Campanhas de triagem de alto rendimento de descoberta de medicamentos de milhares de compostos podem produzir um grande número de hits mostrando interação potencial com o alvo dos medicamentos. As afinidades de ligação podem ser derivadas de análises de estado estável de muitos ensaios de alto rendimento. Para a seleção desses hits com potencial para desenvolvimento adicional, é necessária uma caracterização completa da cinética de ligação. Isso identifica compostos que trazem especificamente para o alvo desejado com taxas de ligação cinética favoráveis. Na prática, isso significa que estudos cinéticos extensivos devem ser realizados em um grande número de compostos hit de triagem. Até o momento, essa é uma tarefa extremamente demorada, além de demandar muito material. Séries de diluição adequadas de centenas de compostos hit devem ser preparadas e cada concentração deve ser injetada em réplicas. A Creoptix desenvolveu uma nova tecnologia que pode tornar esses projetos muito mais eficientes, permitindo uma caracterização cinética robusta de uma amostra em uma única concentração. A waveRAPID da Creoptix no WAVE da Creoptix representa uma mudança de paradigma para medições cinéticas em um cenário de triagem.

No presente estudo, realizado por um grupo de descoberta de medicamentos HTS do nosso cliente Idorsia Pharmaceuticals Ltd, demonstramos o poder do waveRAPID na simplificação da caracterização cinética de um grande número de compostos hit de medicamentos. Em vários experimentos, a cinética de ligação de até 146 compostos hit foi determinada pelo waveRAPID, utilizando injeções pulsadas de amostras em uma única concentração no alvo do medicamento previamente imobilizado na matriz do sensor. Todos os compostos analisados foram estudados antes da instrumentação de SPR de última geração, usando medições cinéticas tradicionais de vários ciclos. 

A comparação dos dados obtidos das duas tecnologias revelou excelente correlação para as constantes de dissociação calculadas (K_D) com apenas alguns valores discrepantes. Esse resultado valida a tecnologia waveRAPID no WAVE da Creoptix para a aplicação na descoberta precoce de medicamentos, permitindo a geração de dados cinéticos em profundidade em uma configuração de triagem com alta produtividade. Como o tempo para caracterizar cada composto é reduzido a apenas alguns minutos, é possível obter uma economia significativa de tempo e materiais. Grandes campanhas para determinar a cinética de ligação de centenas de compostos podem ser realizadas em dias, em vez de semanas, em comparação com os atuais instrumentos de SPR de última geração. 

Além disso, a tecnologia waveRAPID gerou dados robustos mesmo para compostos difíceis (como aqueles que mostram grande contribuição de índice de refração em massa ou dissociação lenta) em toda a série de ensaios. Esses compostos frequentemente requerem regeneração superficial e nova imobilização da proteína do ligante. Isso interrompe o fluxo de trabalho durante campanhas de medição maiores usando ensaios tradicionais de vários ciclos. Por fim, o WAVE da Creoptix, bem como o novo método waveRAPID, possibilita uma configuração de ensaio extremamente direta, oferecendo análise cinética de ligação completa a partir de uma única concentração por amostra. Além disso, a cinética direta, o mecanismo de avaliação exclusivo e inovador da Creoptix, baseado na estimativa de parâmetros estatísticos, oferece um fluxo de trabalho de análise automatizado e robusto, incluindo cálculo de erros estatísticos reais. A tecnologia waveRAPID e o mecanismo de avaliação automática de cinética direta representam um pacote poderoso que tem o potencial de transformar a forma como atualmente os ensaios de ligação cinética são realizados no início da descoberta de medicamentos.

Materiais e métodos

Protocolo da Creoptix

A proteína alvo com etiqueta histidina 1 e a proteína alvo com etiqueta histidina 2 foram capturadas com uma densidade de 4000 a 5000 pg/mm² em um WAVEchip 4PCP-NTA previamente carregado com íons Ni²⁺. As injeções pulsadas do waveRAPID de compostos foram feitas a partir de uma solução de amostra de 10 μm por 25 s, seguidas de injeção de tampão por 250 s com uma vazão de 32,5 μl/min por célula de fluxo. Todas as medições foram realizadas em tampão fosfato de 50 mM com 0,05% de Tween-20 e 5% de DMSO. Os dados foram referenciados duas vezes subtraindo o sinal do canal de referência e as injeções em branco. A concentração aparente dos compostos na área de detecção sobre os 6 pulsos de injeção foi calibrada com uma injeção pulsada de tampão de corrida suplementado com 0,5% de DMSO adicional usando os mesmos parâmetros de injeção das amostras compostas. A análise cinética foi realizada pelo mecanismo de estimativa de Cinética direta usando um modelo de ligação 1:1.

Protocolo da Biacore

A proteína alvo com etiqueta histidina 1 e a proteína alvo com etiqueta histidina 2 foram capturadas com uma densidade de 4000 a 5000 pg/mm² em um chip Ni-NTA previamente ativado com íons Ni²⁺. Os analitos foram ajustados para a concentração desejada por uma diluição em série em um tampão de corrida (tampão fosfato de 50 mM com 0,05% de Tween-20 e 5% de DMSO). Os sensorgramas foram obtidos com tempo de associação de 100 s, tempo de dissociação de 250 s e vazão de 40 μl/min. Para determinar a cinética de ligação (k_associado, k_dissociado e K_d), os sensorgramas obtidos após dupla referência foram analisados pelo software Biacore T200 Evaluation utilizando um modelo de ligação 1:1.

Resultados

A nova tecnologia waveRAPID para a rápida aquisição de dados de ligação cinética em um cenário semelhante ao de triagem foi validada em relação à instrumentação e metodologia de última geração neste estudo. Conforme mostrado na Figura 1, os dados de ligação cinética podem ser gerados rapidamente para um grande número de compostos hit de triagem, por injeção pulsada de cada amostra em uma única concentração. Incluindo a dissociação do analito, cada medição levou cerca de 5 minutos. Os perfis de resposta típicos gerados pelo waveRAPID são mostrados na Figura 1, painéis A e B (dados em vermelho, com o modelo cinético 1:1 em preto). Os parâmetros avaliados são mostrados em um mapa de taxa no painel C (composto de controle injetado sobre todo o ensaio no círculo preto), demonstrando excelente reprodutibilidade. Os tempos de ensaio típicos e o rendimento da amostra em comparação a um ensaio exemplar com 384 amostras em dois alvos estão listados na Tabela 1. 

Figura 1: aplicação da GCI no WAVEdelta da Creoptix para descoberta e caracterização precoce de hits de medicamentos usando a nova tecnologia waveRAPID. A caracterização cinética completa pode ser derivada de compostos injetados em uma única concentração, em uma configuração de triagem com waveRAPID, possibilitando uma grande economia de tempo e custo na descoberta precoce de hits de medicamentos.
(a) É mostrada uma seleção representativa de perfis de resposta do waveRAPID de uma triagem de 80 compostos.
(b) Usando configurações de injeção personalizadas de predefinições selecionáveis no WAVEcontrol, toda a gama de afinidades pode ser coberta. Aqui, foram utilizados ajustes para aglutinantes intermediários (injeção pulsada de 20 segundos, dissociação de 250 segundos), possibilitando a resolução de afinidades de nanomolares baixos até micromolares baixos.
(c) As taxas de cinética são mostradas em um mapa de taxas com afinidades idênticas nas linhas diagonais. Os pontos de dados no círculo mostram a excelente reprodutibilidade do composto de controle em todo o ensaio.

Tabela 1: Tempos de execução de ensaio exemplares e produtividade de amostras em comparação ao waveRAPID no WAVEdelta com tecnologias de última geração (Biacore T200, 8k) para caracterização cinética completa de 384 amostras em 2 alvos.

Os dados cinéticos obtidos foram filtrados em relação a erros nas taxas de ligação (abaixo de 100% do k_a absoluto e abaixo de 50% do k_d absoluto) e comparados com os dados das medições padrão de SPR de vários ciclos. Conforme mostrado na Figura 2, a comparação com as medições tradicionais de SPR de vários ciclos revela uma boa correlação entre os dois conjuntos de dados. 

Figura 2: a cinética de ligação de hits da triagem de medicamentos medida com o waveRAPID no WAVEdelta da Creoptix é traçada em relação aos valores obtidos pelas medições cinéticas tradicionais de vários ciclos realizadas em um instrumento Biacore T200. Os dados do waveRAPID foram filtrados quanto a erros estatísticos na taxa de associação (k_a) abaixo de 100% e na taxa de dissociação (k_d) abaixo de 50% do parâmetro de taxa calculado. A correlação valida o método da cinética do waveRAPID dez vezes mais rápido em comparação com o método tradicional.

Para desafiar ainda mais o sistema, outra série de medição foi realizada, onde compostos mais difíceis causando interrupções no fluxo de trabalho e regeneração de superfície nas medições tradicionais de vários ciclos foram executados durante todo o ensaio. Presumivelmente devido ao tempo de contato significativamente menor do analito com a proteína alvo, essas moléculas difíceis (mostrando resposta em massa alta ou dissociação lenta) não interrompem o fluxo de trabalho geral no WAVE e tornam desnecessária qualquer regeneração intermitente da superfície. Como mostra a Figura 3, os parâmetros de ligação cinética de quase todos os compostos de interesse ainda poderiam ser avaliados de forma robusta com erros baixos e o controle positivo ainda demonstrou alta reprodutibilidade.

Figura 3: trinta compostos previamente caracterizados foram medidos novamente em um ensaio contendo também 30 compostos mais desafiadores, mostrando alta contribuição do índice de refração (RI) em massa ou dissociação lenta, bem como o composto desafiador injetado em todo o ensaio. Enquanto os compostos desafiadores causavam grandes limitações de fluxo de trabalho na cinética tradicional de vários ciclos, tornando necessária a regeneração regular da superfície, o waveRAPID possibilitou um fluxo de trabalho contínuo com tempo de medição contínuo e sem supervisão. Os erros estatísticos em porcentagem das constantes da taxa de associação e dissociação calculadas absolutas, conforme determinado pelo mecanismo de estimativa de Cinética direta da Creoptix, são plotados nos eixos horizontal e vertical, respectivamente. Os compostos que não apresentaram comportamento difícil em ensaios anteriores (marcas verdes), bem como réplicas do composto de controle (marcas roxas), são claramente identificados por erros baixos. Além disso, os compostos que apresentam dificuldades em ensaios anteriores devido à grande contribuição do índice refrativo em massa podem ser analisados de forma robusta no WAVE com erros baixos (marcas azuis). Os compostos restantes difíceis de analisar são claramente caracterizados por erros maiores (marcas vermelhas).

Conclusões

Com alta sensibilidade, a capacidade de resolver interações extremamente rápidas e a tecnologia de ensaio do waveRAPID, o WAVEsystem possibilita a caracterização cinética de grandes números de compostos hit de medicamentos em um tempo significativamente menor em comparação com os ensaios cinéticos tradicionais de vários ciclos. Ao obter cinética de um único poço em uma injeção, o consumo de reagentes e amostras é reduzido para beneficiar significativamente a descoberta precoce de medicamentos. Além disso, o waveRAPID oferece:

• Resultados comparáveis à SPR tradicional em um tempo muito menor
• Tempo de contato reduzido, preservando a proteína alvo e permitindo ensaios ininterruptos mais longos
• Alta reprodutibilidade e confiança nos resultados
• A cinética de ligação de uma única injeção para selecionar hits com base nos parâmetros relevantes
• Mais interações caracterizadas em dias em vez de semanas
• Cálculo de erros estatísticos profundos para descobrir hits relevantes e filtrar compostos problemáticos

Principais conclusões

• O tempo reduzido de contato da amostra preserva a integridade alvo para execuções mais longas
• Cinética de ligação de uma única injeção
• Reprodutível e comparável às tecnologias de SP tradicionais

Excelente para:

• Triagem de misturas brutas: moléculas pequenas, fragmentos e peptídeos
• Progressão rápida do hit (substância ativa) ao lead (protótipo)
• Otimização do lead (protótipo)
• Alvos instáveis
• Compostos difíceis
  

Agradecimentos

Agradecemos a Geoffroy Bourquin, Laksmei Goglia, Solange Meyer e Oliver Peter por realizarem todos os experimentos e contribuírem para este documento.