Cinética de ligação de um GPCR

Introdução

Os receptores acoplados à proteína G (GPCRs) compreendem uma grande classe de proteínas integrais de membrana, cruciais para a transdução de estímulos extracelulares através da membrana plasmática para provocar respostas moleculares e celulares. Eles regulam uma variedade de processos fisiológicos em eucariontes e representam o maior grupo de metas terapêuticas, com mais de 30% dos produtos farmacêuticos disponíveis visando aos GPCRs.

As proteínas da membrana são notoriamente difíceis de estudar devido à necessidade de um ambiente que simule a membrana e sua instabilidade uma vez extraída de uma membrana celular. Mostramos aqui a capacidade do WAVE da Creoptix de medir a interação de um agonista de ligante peptídico (NTA11) com uma variante termoestabilizada do receptor neurotensina 1 (NTSR1)¹ na resolução mais alta. Esse GPCR media as várias funções da neurotensina, como hipotensão, hiperglicemia, hipotermia, antinocicepção e regulação da motilidade e secreção intestinais².

Materiais e métodos

O receptor foi biotinilado in vivo via avi-tag e capturado em um sensor pré-revestido de estreptavidina (WAVEchip DXH-STA). Para o agonista peptídico medido, utilizou-se uma forma mutada e truncada de neurotensina (Mw 725 Da), compreendendo os resíduos de 8 a 13 com substituição de Y11A. As curvas dose-resposta foram registradas para 7 concentrações diferentes de analitos de uma série de diluição de 3 vezes com 300 nM sendo a concentração mais alta. A taxa de fluxo foi definida para 30 μL/min. O tampão de corrida foi de 50 mM Tris pH 7,5, 150 mm de NaCl e 0,1% (w/v) do detergente lauril neopentilglicol maltose (L-MNG)³. Todas as medições foram realizadas a 25 °C.

Resultados

O receptor neurotensina purificado e biotinilado foi capturado em um sensor pré-revestido de estreptavidina (WAVEchip DXH-STA) com densidade de 1350 pg/mm². Foram registradas curvas dose-resposta para ligação de agonista peptídico (Figura 1), gerando dados de ligação que poderiam ser bem ajustados com um modelo para uma interação 1:1, incluindo um termo para transporte de massa (MTL). As taxas cinéticas obtidas e a constante de equilíbrio estão resumidas na Tabela 1.

Figura 1: sensorgramas da interação entre um peptídeo neurotensina modificado (MW 725 Da) como analito e um receptor neurotensina termoestabilizado (NTSR1, complexo de proteínas/detergentes de 70 kDa) como ligante. Os dados foram equipados com um modelo para uma interação 1:1 incluindo um termo para limitação de transporte de massa (MTL) usando o software WAVEcontrol

Tabela 1: taxas cinéticas e constante de dissociação para o agonista NTA11 obtidas com um modelo de interação 1:1 incluindo um termo para limitação de transporte de massa (MTL)

Referências

1. Egloff, P., Hillenbrand, M., Klenk, C., Batyuk, A., Heine, P., Balada, S., Schlinkmann, K. M., Scott, D. J., Schütz, M., and Plückthun, A. (2014) Structure of signaling-competent neurotensin receptor 1 obtained by directed evolution in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111, E655–62.
2. Krumm, B. E., and Grisshammer, R. (2015) Peptide ligand recognition by G protein-coupled receptors. Front. Pharmacol. 
3. Chae, P. S., Rasmussen, S. G. F., Rana, R. R., Gotfryd, K., Chandra, R., Goren, M. a, Kruse, A. C., Nurva, S., Loland, C. J., Pierre, Y., Drew, D., Popot, J., Picot, D., Fox, B. G., Guan, L., Gether, U., Byrne, B., Kobilka, B., and Gellman, S. H. (2010) Maltose-neopentyl glycol (MNG) amphiphiles for solubilization, stabilization and crystallization of membrane proteins. Nat. Methods 7, 1003–1008.