La medida confiable de la cinética de unión de analitos de bajo peso molecular a sus objetivos sigue siendo una tarea difícil. A menudo, la introducción de etiquetas es simplemente imposible en tales medidas, y la aplicación de métodos sin etiquetas es la única opción confiable.
Al medir la cinética de unión de los iones Ni(II) a las capas de flagelina modificadas genéticamente, demostramos que: (1) La interferometría acoplada a la rejilla (GCI) es adecuada para resolver la unión de iones, incluso a niveles de inmovilización de proteínas muy bajos; (2) suministra datos cinéticos de alta calidad a partir de los cuales se puede determinar la cantidad y la fuerza de los sitios de unión disponibles, y (3) las constantes de velocidad de los eventos de unión también se pueden obtener con alta precisión. Los experimentos se realizaron utilizando una variante de flagelina que incorpora el dominio C-terminal del factor de transcripción NikR que responde al níquel.
Los resultados de la GCI se compararon con los datos de afinidad de la calorimetría de titulación. Hallamos que además de los sitios de unión de baja afinidad caracterizados por una constante de disociación micromolar (Kd), las moléculas tetraméricas FliC-NikRC poseen sitios de unión de alta afinidad con valores Kd en el rango nanomolar. La GCI nos permitió obtener datos cinéticos en tiempo real de la unión específica de un analito con una masa molar tan baja como 59 Da, incluso con señales inferiores a 1 pg/mm2.
La medida confiable de la cinética de unión de analitos de bajo peso molecular a sus objetivos sigue siendo una tarea difícil. A menudo, la introducción de etiquetas es simplemente imposible en tales medidas, y la aplicación de métodos sin etiquetas es la única opción confiable.
Al medir la cinética de unión de los iones Ni(II) a las capas de flagelina modificadas genéticamente, demostramos que: (1) La interferometría acoplada a la rejilla (GCI) es adecuada para resolver la unión de iones, incluso a niveles de inmovilización de proteínas muy bajos; (2) suministra datos cinéticos de alta calidad a partir de los cuales se puede determinar la cantidad y la fuerza de los sitios de unión disponibles, y (3) las constantes de velocidad de los eventos de unión también se pueden obtener con alta precisión. Los experimentos se realizaron utilizando una variante de flagelina que incorpora el dominio C-terminal del factor de transcripción NikR que responde al níquel.
Los resultados de la GCI se compararon con los datos de afinidad de la calorimetría de titulación. Hallamos que además de los sitios de unión de baja afinidad caracterizados por una constante de disociación micromolar (Kd), las moléculas tetraméricas FliC-NikRC poseen sitios de unión de alta afinidad con valores Kd en el rango nanomolar. La GCI nos permitió obtener datos cinéticos en tiempo real de la unión específica de un analito con una masa molar tan baja como 59 Da, incluso con señales inferiores a 1 pg/mm2.
