Temperatura de Agregación (Tagg) – ¿qué es y cómo podemos calcularla?

Midiendo la temperatura de agregación usando el Zetasizer

En la dispersión de luz dinámica (DLS), se puede obtener el tamaño hidrodinámico y la distribución de tamaño de las partículas en solución. Puede ser de interés examinar esta medición como una función del tiempo y la temperatura, o como una ‘tendencia’, como se llama en el software de Malvern Zetasizer. Para muestras de proteínas biológicas, esta tendencia de temperatura es particularmente interesante: aunque a bajas temperaturas una proteína puede ser estable y mostrar mediciones de tamaño (e intensidad de dispersión) repetibles, típicamente a alguna temperatura elevada (T_agg), las moléculas de proteína mostrarán una tendencia a oligomerizar o agregarse. La temperatura a la que esto ocurre dependerá de la propia proteína, además de la composición del tampón, y generalmente solo se observa claramente cuando la proteína inicial es homogénea al comienzo de la medición.

Un ejemplo, que discute la estabilidad de la albúmina humana recombinante, se comenta en la nota de aplicación, «Usar la dispersión de luz para estudiar la estabilidad térmica de la Recombumina – prediciendo la vida útil«.

¿Cómo se determina T_agg?

El método tradicional para determinar la temperatura de agregación T_agg consistía en observar la intensidad normalizada frente a la temperatura. El punto de agregación era el primer punto en el que la pendiente era mayor que 10, donde la pendiente incluye los 5 puntos de datos anteriores. Este método se podía modificar para observar el tamaño z-medio, o incluso el índice de polidispersidad. El software actual contiene dos algoritmos de ajuste:

• análisis de parámetro único (solo tasa de conteo)
• análisis multi-parámetro (tamaño y tasa de conteo)

El ajuste multi-parámetro considera tanto el cambio en el tamaño hidrodinámico (z-medio) como en la tasa de conteo de dispersión (derivada) y es el método preferido. Una captura de pantalla del software actual muestra una diferencia típica entre los dos métodos de análisis.

Como ejemplo para el punto de temperatura de agregación de la hemoglobina proporcionado en el archivo Example Results.dts, el antiguo método de parámetro único dio un resultado de 38ºC, mientras que el nuevo método multi-parámetro dio un resultado de 42ºC. El cambio absoluto no es de mucha preocupación, siempre y cuando se use el mismo método al comparar diferentes conjuntos de datos. Para ver este menú para cualquier conjunto de datos, resalte un registro, haga clic derecho y seleccione editar resultado.

¿Por qué es T_agg diferente de T_melt?

La temperatura de agregación detecta el inicio de la agregación; la temperatura a la que las moléculas tienen tendencia a agregarse. La temperatura de fusión, T_melt o T_m, por otro lado, es el resultado de la desnaturalización (casi) completa de la proteína. Se puede determinar, por ejemplo, mediante calorimetría de barrido diferencial (DSC) o con dicroísmo circular (CD), que pueden detectar pequeños cambios en la capacidad térmica y la estructura en general, respectivamente. Debido a la extrema sensibilidad de la dispersión de luz a pequeños cambios de tamaño molecular y al inicio de la oligomerización, la temperatura de agregación (T_agg) generalmente se observa inferior a la temperatura de fusión (T_melt).

¿Cómo configurar una medición para T_agg?

El Zetasizer permite mediciones de tendencia automatizadas frente a la temperatura. Para acceder al menú, ya sea inicie una medición manual o cree un SOP. Luego, seleccione en la esquina superior izquierda de la ventana Tipo de Medición – Tendencia – Temperatura – Tamaño, que comenzará con algunos ajustes predeterminados. Recorra los ítems del menú, en particular la secuencia de tendencias, donde la temperatura de inicio y fin, así como el intervalo de temperatura se pueden ingresar. Marque junto a «verificar punto de agregación». Bajo la configuración de «Medición de Tamaño», proporcione el tiempo de equilibrado en cada paso. Recomiendo marcar junto a «permitir que se guarden resultados que contengan solo datos de correlación». Esto incluso guardará datos cuando la muestra esté bastante agregada (es decir, más allá de la temperatura de agregación) y puede ser útil tenerlos.

El SOP estima la duración del experimento y esto se muestra en las secciones de tendencia y de Medición de Tamaño (puede requerirse hacer clic en otra cosa para actualizar el cálculo). El SOP o la medición manual luego se pueden iniciar como una medición regular.

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