Mejores Prácticas para la Calorimetría de Barrido Diferencial de Proteínas y Biopolímeros

por Verna Frasca, Tuesday, 14th August 2018

En un blog anterior, hablé sobre las mejores prácticas para obtener datos de alta calidad con un MicroCal DSC. Aquí hay más mejores prácticas para el sistema MicroCal PEAQ-DSC, así como los sistemas MicroCal VP-Capillary DSC y VP-DSC. Estas mejores prácticas se aplican al análisis de proteínas en solución y otros biopolímeros.

Requisitos de la muestra:

Para datos de alta calidad de Calorimetría de Barrido Diferencial (DSC), las muestras deben estar en el tampón deseado (pH, sal, excipientes, etc.), y el tampón coincidente se utiliza en la celda de referencia de DSC y para escaneos tampón-tampón.
Prepare las muestras en el tampón deseado mediante diálisis, una columna de desalinización, u otro método de intercambio de tampón.
Guarde el tampón de la diálisis/intercambio de tampón para usar en la celda de referencia, escaneos tampón-tampón, y dilución de la muestra.
Rango de concentración de proteína recomendado de 0.1 mg/ml a 2 mg/ml.
Los T_ms del DSC pueden depender de la concentración.
- Para el cribado de T_m y estudios de comparabilidad/similitud, asegúrese de que todas las proteínas tengan la misma concentración.

Configuraciones de DSC:

Al usar DSC para el cribado de T_m y estudios de comparabilidad/similitud, asegúrese de que todas las configuraciones sean las mismas, incluyendo la tasa de escaneo, el rango de temperatura, el modo de retroalimentación, el termostato previo al escaneo.
- Los T_m y los termogramas del DSC pueden depender de la tasa de escaneo y el modo de retroalimentación.
Rango de temperatura: inicie el escaneo 10-20°C por debajo del primer T_m y termine el escaneo 10-20°C por encima del T_m final.
Tasas de escaneo:
- Tasa típica de escaneo para proteínas y ácidos nucleicos es de 60 a 90 °C/h
- Tasa típica de escaneo para lípidos es de 30 a 60°C/h
- Para MicroCal PEAQ-DSC y VP-Capillary DSC, use una tasa de escaneo de 180 a 240 °C/h para aumentar el rendimiento de muestra durante el cribado de T_m
“Modos de Retroalimentación” recomendados:
- proteínas – ninguno o bajo
- ADN y ARN – bajo o medio
- Lípidos – alto
“Termostato previo al escaneo” recomendado de 3 a 15 minutos.

Para los sistemas automatizados MicroCal PEAQ-DSC y VP-Capillary DSC:

Asegúrese de que las muestras se almacenen a una temperatura adecuada antes del análisis de DSC. Para proteínas y otras biomoléculas, configure la temperatura de la pila de refrigeración entre 5 y 10°C. Si está estudiando un material termostable, puede configurar la pila de refrigeración a 25°C.
Use un mínimo de tres recargas de purga (llamadas “número de golpes de llenado” en el VP-Capillary DSC) para llenar las celdas de DSC desde la placa de 96 pocillos.
Programe la limpieza de celdas usando 20% de Contrad 70 o 14% de Decon 90.

Calidad de datos crudos de DSC:

Siempre tenga un escaneo tampón-tampón coincidente (ejecutado bajo condiciones de escaneo idénticas) para usar en el análisis de datos. Si lo desea, puede realizar un escaneo tampón-tampón antes de cada muestra.
Escaneos frecuentes tampón-tampón sirven como una verificación adicional del rendimiento del instrumento para asegurarse de que las celdas de la DSC estén limpias y el instrumento funcione correctamente.
Los escaneos tampón-tampón deben ser reproducibles durante toda la secuencia (suponiendo los mismos parámetros de ejecución de DSC).
Con el PEAQ-DSC Automatizado, y su bomba de lavado eficiente y protocolos de limpieza de celdas DSC optimizados, es posible ejecutar tres (o más) muestras seguidas, sin realizar escaneos tampón-tampón intermedios.
El valor DP (en mcal/min) para el termograma crudo de DSC debe ser cercano a cero al iniciar los escaneos tampón-tampón o agua-agua.
Al inicio de los escaneos de proteínas, el valor DP típicamente se vuelve más negativo, en comparación con escaneos tampón-tampón coincidentes. Concentraciones más altas de proteínas tienen una desviación negativa mayor. Con una buena concordancia del tampón, esta diferencia de DP debería ser aproximadamente 0.15 a 0.25 mcal/min por cada 1 g/L de proteína (Figura 1).
Si la diferencia de DP entre los escaneos de proteína y tampón-tampón es mayor a 1 mcal/min, esto puede deberse a una falta de concordancia del tampón entre la proteína y el tampón, una celda sucia, una celda subllena, burbujas en la celda, o proteína más concentrada (Figura 2).