Prácticas recomendadas para la calorimetría de titulación isotérmica para estudiar interacciones de unión – Parte 1

Aquí hay varias prácticas recomendadas para realizar experimentos de unión tradicionales con los sistemas MicroCal PEAQ-ITC, VP-ITC e ITC200.   

Requisitos de la muestra:

• • Por convención, la “macromolécula” es la biomolécula en la celda de los calorímetros de titulación isotérmica (ITC), y el “ligando” es la biomolécula en la jeringa de ITC. Estos pueden ser cualquier molécula (proteína, ácido nucleico, inhibidor de molécula pequeña, metal, etc.) que interaccionen entre sí. También se pueden realizar “titulaciones inversas”, con el “ligando” en la jeringa.
  • El “ligando” tiene un sitio de unión, para fines de análisis de datos en el modelo de unión de un conjunto de sitios, y otros modelos de análisis de datos de ITC comúnmente utilizados. La “macromolécula” puede tener cualquier número de sitios de unión.
  • Todas las muestras deben ser lo más puras posible para ITC. Evite o elimine impurezas químicas y conformacionales, ya que pueden impactar en la determinación precisa de la concentración, y posiblemente estar involucradas en o interferir con la interacción de unión.
  • Para datos ITC de alta calidad, ambas biomoléculas deben estar emparejadas en el tampón deseado, para evitar cambios de calor debido a un desajuste de tampones.

• Tampón para ITC:
  • Use un tampón que mantenga la solubilidad y estabilidad de las biomoléculas, e incluya cualquier sal, cofactor o aditivo necesario para la unión.
  • Como punto de partida, puede utilizar el mismo tampón utilizado para otros estudios de unión.
  • ITC es compatible con tampones acuosos entre pH2-pH12. Asegúrese de que la concentración del tampón sea suficiente para mantener el pH en presencia de las biomoléculas.
  • Si el tampón contiene glicerol (u otro componente viscoso), mantenga la concentración de glicerol por debajo del 20% (v/v), para evitar burbujas en la celda de ITC y la jeringa de inyección.
  • Si el tampón contiene un tensioactivo o detergente, mantenga la concentración del tensioactivo por debajo de su concentración crítica de micelas (CMC) a menos que esté estudiando micelas con ITC.
  • Si se necesita un agente reductor, recomendamos usar TCEP o 2-mercaptoetanol. No se recomienda el ditiotreitol.
  • Si un ligando necesita DMSO para su solubilidad, asegúrese de que tenga la misma concentración final de DMSO en ambos socios de unión. El límite superior recomendado es 10% de DMSO para estudios de unión ITC.
  • Si necesita utilizar otro disolvente orgánico, consulte la literatura técnica del instrumento, o consulte con su equipo de soporte regional de Malvern Panalytical, para recomendaciones y la compatibilidad química de su sistema ITC.

Volúmenes de muestra:

• Vea la Tabla 1. Estos son los volúmenes recomendados necesarios para llenar la celda y la jeringa de ITC utilizando protocolos recomendados, sin la adición de burbujas.

Concentraciones de muestra:

• La concentración inicial de la macromolécula en la celda de ITC se determina típicamente por el “parámetro C” o “factor de sigmoidalidad”, determinado por:
  C= N[M]_T/K_D       
• [M]T es la concentración de macromoléculas en la celda de ITC, y N es la estequiometría. Para obtener un isotermo de unión ITC razonable, el rango óptimo es 5 < C < 500. En muchos casos, puede obtener datos útiles de una curva de unión ITC cuando C está entre 1 y 1000.
• Para una unión 1:1, comience con una concentración de ligando 10 veces mayor en la jeringa de ITC, en comparación con la concentración de macromoléculas en la celda de ITC.
• Si tiene un K_D estimado, y hay una unión 1:1, use la guía en la Tabla 2. Asumiendo que hay un cambio de calor y entalpía de unión razonables, estas concentraciones deberían proporcionar una curva de unión.
• Si K_D es desconocido, pruebe con 20 μM de muestra en la celda de ITC y 200 μM de muestra en la jeringa de ITC.
• Concentración mínima en la celda de ITC: 5-10 μM
• Concentración mínima en la jeringa de ITC: 50 μM

Tabla 2: Concentraciones recomendadas para experimentos ITC si tiene un KD estimado y unión 1:1[/caption>

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Publicaciones anteriores:

• Prácticas recomendadas para ITC para estudiar interacciones de unión – Parte 2
• Prácticas recomendadas para ITC para estudiar interacciones de unión – Parte 3
• Prácticas recomendadas para ITC para estudiar interacciones de unión – Parte 4
• Calorimetría de titulación isotérmica – Una herramienta caliente de caracterización para interacciones biomoleculares
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