Reducir el riesgo de la estabilidad antes de que se convierta en un problema
Un candidato que supera el cribado de unión no es necesariamente un candidato que sobrevivirá al desarrollo.
La agregación, la inestabilidad coloidal y la sensibilidad térmica se encuentran entre las causas más comunes de que los biológicos fallen en etapas posteriores, y a menudo pasan desapercibidas porque las mediciones capaces de detectarlas se aplican demasiado tarde.
La ventana entre la confirmación del hit y la nominación del lead es donde el riesgo de estabilidad es más manejable. En esta etapa, los volúmenes de muestra son pequeños, la cartera de candidatos sigue siendo lo bastante amplia como para hacer selecciones significativas, y el coste de eliminar una molécula problemática es una fracción de lo que será varios meses más adelante en el programa. A medida que un programa de biológicos pasa de la fase de descubrimiento y desarrollo temprano a la etapa preclínica, la validación de hits da paso a la optimización de leads y candidatos, con una exigencia creciente de una caracterización biofísica más profunda y extensa. Este es el punto en el que el cribado de estabilidad pasa de ser un papel de apoyo a uno central.
En este blog, nos centramos en el poder de la dispersión dinámica de luz (DLS) y la dispersión estática de luz (SLS) como base del cribado temprano de estabilidad, y en cómo trabajan junto con el análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA) y la calorimetría diferencial de barrido (DSC) para construir una imagen completa de la desarrollabilidad del candidato.
Por qué el riesgo de estabilidad es un problema oculto
Una molécula que se une a su diana con alta afinidad aún puede agregarse en condiciones de formulación, desnaturalizarse durante el almacenamiento o comportarse de forma impredecible a las concentraciones requeridas para la administración subcutánea.
Sin embargo, la posibilidad de que surjan estos problemas es en gran medida invisible para los ensayos de unión y actividad que dominan el cribado temprano. Un cribado de unión de alto rendimiento puede decirte que una molécula interactúa con su diana, pero no te dice nada sobre si esa molécula permanecerá monodispersa a altas concentraciones, resistirá tres ciclos de congelación/descongelación o mantendrá su estructura de orden superior en todo el rango de pH de un tampón de formulación típico.
El cribado temprano de estabilidad biofísica está diseñado para cerrar esta brecha mediante la incorporación de lecturas ortogonales que los datos de unión no pueden proporcionar.
Qué revelan DLS y SLS —y por qué importa pronto
La dispersión dinámica de luz en la gama Zetasizer Advance mide el radio hidrodinámico de las proteínas en solución aprovechando la relación entre el tamaño de partícula y la tasa de difusión. Para los candidatos biofarmacéuticos, es una de las mediciones tempranas con mayor densidad de información disponibles. Además, es rápida de ejecutar, requiere muy poca muestra y es sensible a cambios diagnósticamente significativos mucho antes de que se hagan visibles por otros medios.
La señal más temprana de formación de agregados
La dependencia a la sexta potencia de la intensidad de dispersión de luz con respecto al tamaño de partícula hace que DLS sea desproporcionadamente sensible a las especies más grandes. Un único agregado en una población predominantemente monomérica genera una señal de dispersión muy desproporcionada con respecto a su contribución de volumen. Esto significa que DLS puede detectar las primeras señales de formación de agregados en un punto en el que sería completamente invisible en una distribución ponderada por volumen o por número. El seguimiento del tamaño y la polidispersidad a lo largo de un gradiente de temperatura proporciona la temperatura de agregación (Tagg), que es un punto medible temprano en el que una formulación comienza a fallar bajo estrés térmico.
Predecir el comportamiento a concentraciones de formulación
Tagg indica cuándo una proteína se agrega bajo estrés térmico, pero no por qué, ni cómo se comportará el candidato a las altas concentraciones requeridas para la formulación. Para ello, dos parámetros de interacción derivados del mismo flujo de trabajo de medición DLS y SLS proporcionan la respuesta predictiva.
El parámetro de interacción difusiva kD, derivado de mediciones DLS a lo largo de una serie de concentraciones, cuantifica el efecto neto de las interacciones proteína-proteína en solución. Un kD positivo elevado indica interacciones repelentes: un candidato que resiste la autoasociación y probablemente permanecerá estable a concentraciones de formulación. Un kD negativo señala interacciones atractivas, lo que predice una mayor propensión a la agregación y una viscosidad elevada en condiciones de formulación.
El segundo coeficiente virial B22, derivado de mediciones SLS, proporciona el componente termodinámico de la misma الصورة. Los valores positivos de B22 indican que la proteína prefiere asociarse con el disolvente en lugar de autoasociarse, lo que la convierte en un indicador favorable de solubilidad y estabilidad coloidal. Los valores negativos de B22 señalan candidatos con riesgo de agregación o precipitación.
Lo más importante es que ambos parámetros se derivan de los mismos experimentos de serie de concentraciones ya que kD está relacionado con B22. Medir B22 directamente es preferible, porque es la medida termodinámica, dependiente de la concentración, de la atracción/repulsión neta entre proteínas y, por tanto, más directamente interpretable para el riesgo de agregación, mientras que kD es una proxy indirecta basada en la difusión que puede verse distorsionada por muchos factores como el tamaño molecular, la fricción y la viscosidad.
Esto significa que kD, B22, Tagg, PDI y la distribución de tamaños de partícula pueden obtenerse todos a partir de un único instrumento Zetasizer Advance mediante un flujo de trabajo de medición coordinado. Este es el valor práctico del cribado temprano con DLS y SLS: identificar las condiciones en las que es más probable que se produzca la agregación, antes de que se hayan comprometido recursos significativos en una formulación.
Resolución de poblaciones complejas con NTA
DLS mide un promedio de conjunto de la población global. En muestras heterogéneas en las que las especies agregadas abarcan un amplio rango de tamaños, el análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA) en el NanoSight Pro proporciona datos de tamaño y concentración partícula por partícula que el DLS de conjunto no puede resolver.
Las dos técnicas son complementarias: DLS para velocidad, sensibilidad y obtención de parámetros coloidales; NTA para resolver y cuantificar las poblaciones agregadas más grandes que requieren una vista de mayor resolución.
Qué añade DSC a la imagen
DSC complementa a DLS y SLS al caracterizar la estabilidad estructural y determinar cómo responde la arquitectura plegada de la proteína al estrés térmico.
El MicroCal PEAQ-DSC mide el calor absorbido por una proteína a medida que se despliega al aumentar la temperatura. La temperatura de fusión (Tm) es la temperatura a la que el 50 % de la población proteica se ha desplegado. Una Tm más alta generalmente se correlaciona con una mejor estabilidad real en condiciones de almacenamiento, y una Tm más baja es un indicador temprano bien establecido de riesgo de formulación.
Los datos combinados de DSC y DLS proporcionan la capacidad de distinguir entre dos modos de fallo mecanísticamente distintos: la agregación acoplada al despliegue y la agregación que ocurre a temperaturas por debajo de la desnaturalización como un evento puramente coloidal.
Estos dos escenarios tienen implicaciones diferentes para la estrategia de formulación y efectos muy distintos en el desarrollo posterior. Identificar pronto qué modo se aplica a un candidato dado puede evitar que un equipo de formulación pase meses optimizando condiciones para una molécula con una desventaja intrínseca que no puede resolverse por completo.
Del cribado a la desarrollabilidad
Usadas conjuntamente y aplicadas pronto, la combinación de DLS, SLS, NTA y DSC ofrece a los equipos de desarrollo los datos necesarios para tomar mejores decisiones sobre candidatos en el momento en que el fracaso todavía puede evitarse.
Un candidato que muestra una afinidad excelente pero un PDI alto, un kD negativo y una Tm significativamente inferior a la norma del sector ha revelado algo importante: es una desventaja de desarrollabilidad. Detectarlo durante la evaluación del lead candidate es fundamentalmente diferente de detectarlo durante el desarrollo de la formulación, cuando ya se ha nominado un candidato preferente.
De cara al futuro, la aparición de plataformas de alto rendimiento capaces de realizar mediciones de DLS, SLS y estabilidad estructural basadas en fluorescencia intrínseca podría ampliar esta capacidad de cribado temprano a una escala antes impracticable con instrumentos individuales. Esto llevaría la profundidad de caracterización descrita aquí a las etapas más tempranas del embudo de candidatos.
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