Puntos para la medición DSC de proteínas y biopolímeros

MicroCal PEAQ-DSC (calorímetro diferencial de barrido) utilizado para la medición de DSC (calorimetría diferencial de barrido) de proteínas y biopolímeros.

¿En qué debemos prestar atención para obtener datos DSC de alta calidad? ¿Cuál es el estado de la muestra? ¿Cuáles son las condiciones de medición? ¡Comprobémoslo en la siguiente lista!

【Condiciones de la muestra】

Para obtener datos DSC de alta calidad, asegúrate de seguir los siguientes puntos.

• Hacer coincidir la composición del tampón en la celda de muestra y la celda de referencia.
• Ajustar la muestra para que coincida con el tampón deseado mediante diálisis, columna de desalinización u otros métodos de intercambio de tampones.
• Mantener el líquido de diálisis utilizado en el intercambio de tampones y el tampón para uso en la celda de referencia y el escaneo de tampón-tampón (en adelante, escaneo de tampón).
• La concentración de muestra de proteína recomendada es de 0.1 a 2 mg/mL.
• El T_m (temperatura de desnaturalización media) obtenida por DSC depende de la concentración. Por lo tanto, al hacer un cribado de T_m o evaluaciones de equivalencia, iguala todas las concentraciones de muestra.

【Configuración de condiciones de medición】

• Cuando realices el cribado de T_m o evaluaciones de equivalencia por DSC, asegúrate de que todas las condiciones de medición (velocidad de escaneo, rango de temperatura, modo de retroalimentación, termostato previa al escaneo, etc.) coincidan. La forma del termograma se ve afectada por la velocidad de escaneo y el modo de retroalimentación.
• Rango de temperatura: la temperatura de inicio de la medición se establece 10-20°C por debajo del primer valor de T_m y la temperatura final se establece 10-20°C por encima del último valor de T_m.
• Velocidad de escaneo (recomendación general)
  • Proteínas, ácidos nucleicos: 60-90°C/h
  • Lípidos: 30-90°C/h
  Si deseas aumentar la productividad, mide a 180-240°C/h (modelos compatibles: PEAQ-DSC, VP-Capillary DSC)
• Modo de retroalimentación
  • Proteínas: none o low
  • Ácidos nucleicos: low o medium
  • Lípidos: high
• Termostato previa al escaneo: se recomienda de 3 a 15 minutos.

【Puntos a considerar con el sistema de autosampler】

• Considera la estabilidad de la muestra y mantenla a la temperatura adecuada. Si la muestra consiste en proteínas u otras macromoléculas biológicas, establece la temperatura de la pila de enfriamiento a 5-10°C. Si la muestra es estable, 25°C es adecuado.
• Establece Purge/Refills (o número de movimientos de llenado) al menos 3 veces.
• Integra en el método un lavado con detergente de 14% Decon90 (o 20% Contrad70).

【Calidad de datos sin procesar de medición】

• Asegúrate de que el escaneo de muestra y el escaneo de tampón se realicen siempre con las mismas condiciones de escaneo. Realiza un escaneo de tampón antes de cada muestra si es necesario.
• La realización frecuente de escaneos de tampón te permite evaluar que las celdas estén limpias y que el equipo funcione adecuadamente.
• Si estás programando siempre la medición bajo las mismas condiciones de escaneo, la reproducibilidad del escaneo de tampón debe ser alta.
  (En PEAQ-DSC Automated, se proporciona una bomba de lavado con alta eficiencia de limpieza y protocolo de limpieza optimizado. Puedes medir consecutivamente tres muestras (o más) sin necesidad de intercalar un escaneo de tampón entre cada muestra.)
• El valor DP (mcal/min) al inicio de los escaneos de tampón y agua-agua debe ser lo más cercano posible a cero.
• El valor DP en las mediciones de muestra de proteínas será más negativo que en el escaneo de tampón. Cuanto mayor sea la concentración de proteína, más negativo será el valor. Con pequeñas diferencias en la composición del tampón, la diferencia entre el escaneo de muestra y el escaneo de tampón será de aproximadamente 0.15-0.25 mcal/min por cada 1 g/L de concentración de proteína. (Figura 1)

Si hay una diferencia en el valor DP de más de 1 mcal/min entre el escaneo de muestra y el escaneo de tampón, podrían considerarse las siguientes razones. (Figura 2)

• Se produjo un desajuste entre la muestra y el tampón
• La celda estaba sucia
• Relleno insuficiente de la solución
• Ingreso de burbujas
• Muestra de concentración muy alta