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Determinación del Peso Molecular de Proteínas: 

SEC-MALS frente a Calibración Convencional

Las propiedades físicas y el comportamiento de las proteínas en solución varían no solo por varios factores relacionados con la pureza y formulación de la proteína, sino también por características intrínsecas propias.

La cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) es una herramienta poderosa que se utiliza comúnmente para examinar factores como la recuperación, el peso molecular y la agregación de proteínas. 

El principio de la SEC está relacionado con la separación de muestras mientras pasan a través de una matriz de columna que es permeable e inerte. Las moléculas pequeñas pasan más profundamente en los poros y las grandes son excluidas, por lo que pasan más rápido por la columna.  El resultado es una separación basada en el volumen hidrodinámico, pero el objetivo final suele ser determinar el peso molecular.

 Anteriormente, el peso molecular se estimaba comparando el tiempo de elución de una proteína desconocida con proteínas estándar con pesos moleculares conocidos, y este método se llamaba ‘Calibración Convencional’. Este método se realizaba utilizando detectores de concentración única como UV.  

< Malvern Viscotek SEC-MALS 20 sistema > 

Sin embargo, ahora es posible medir el peso molecular de las proteínas independientemente del tiempo de residencia, utilizando un detector de dispersión de luz y un detector de concentración (UV o índice de refracción, RI).  Dado que la mayoría de las proteínas no tienen estructura esférica, esta técnica es muy útil por la inexactitud de los pesos moleculares medidos. La adición de detectores de concentración secundaria como IV (viscosidad intrínseca) o DLS (dispersión de luz dinámica) aumenta significativamente la cantidad de información disponible en una única medición SEC.

El sistema Malvern Viscotek SEC-MALS 20 es un equipo de dispersión de luz con 20 ángulos de detección, capaz de medir el peso molecular de proteínas sin importar el volumen de elución.  Esta nota de aplicación proporciona una guía sobre cómo separar proteínas diversas utilizando SEC. 

Además, se discute la diferencia en los resultados después de medir el peso molecular con MALS (Dispersión de Luz Multiángulo) o con calibración convencional.