Camino al Maestro del Calorímetro Vol.2
¡Vamos a usar el calorímetro de titulación isotérmica iTC200!
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Finalmente, Nakamura visitó la habitación del Profesor Fukada.
¡Profesor Fukada! ¡Cuánto tiempo! ¿Cómo ha estado?
Nakamura, bienvenido. Lo estaba esperando. ¿Cuántos años han pasado? Jeje. Parece que empezarás a usar ITC y DSC.
¡Es cierto! Gracias por su ayuda. Sabía que hacía mediciones cuando era estudiante, pero nunca pensé que yo lo haría también.
Jeje. Así es la vida. Bueno, ¿por dónde empezamos?
He estado haciendo mediciones en la empresa con iTC, pero no salieron bien, así que preparé algunas preguntas.
¡Ah, preparado, veo! Entonces, echemos un vistazo.
El Profesor Fukada revisó las notas de Nakamura.
¿Nakamura? ¿No has usado el sistema en un tiempo?
DP alto y aumento en el nivel de ruido de la línea base son signos de eso.
¿No mejoró tras cambiar el agua de la celda de referencia?
Primero, recomiendo una limpieza exhaustiva.
Además, la limpieza seguirá siendo importante en el futuro.
En mi caso, limpio la celda y la jeringa con detergente y agua ultrapura después de cada medición.
Entonces, cuando DP sale más alto de lo esperado, no es por burbujas, sino porque la celda de muestra estaba sucia.
Creo que sí. Recomiendo limpiar con 20% Contrad 70 o 14% Decon 90 mientras calientas la celda; esto está en el manual.
¡Ah, aquí está! (Manual P41 y (nota 1))
(Nota 1) Para usuarios de VP-ITC, consulte el Manual p.45. Para cambiar temperatura del abrigo, ingrese temperatura en punto de ajuste (°C) en Thermostat/Calib. y clic en Establecer temp. del abrigo.
Profesor, cuando el DP es bajo, pienso que las burbujas han ingresado a la celda de muestra. ¿Cómo evitar que entren?
Al introducir la solución, toma un poco más (350 μL) en la jeringa, acércala al fondo de la celda y aliméntala lentamente.Usualmente, esto es suficiente, pero si usas poca cantidad, como 50 μL, es bueno bombear para crear corrientes dentro de la celda y expulsar burbujas.
El volumen en los conductos hasta la celda suele ser de unos 50 μL, así que si se bombea más, podrías reintroducir burbujas en la celda, así que cuidado.
Además, moviendo la jeringa lentamente hacia arriba y abajo dentro de la celda, puedes liberar burbujas difíciles en la interfase entre celda y conducto.
Y algo importante: si la temperatura de la solución es más baja que la de medición, vuelve a calentarla al nivel adecuado. Aunque la desgasificación no es necesaria para iTC200 (nota 2), repite mediciones y te acostumbrarás, así que persevera.
(Nota 2) Para VP-ITC, desgasifica antes de medir.
Sobre la referencia, ¿por qué es suficiente con agua ultrapura? En los experimentos normales, creo que es mejor ajustar el buffer.
La celda de referencia debe contener solución con la misma capacidad calorífica que la celda de muestra para cancelar fluctuaciones externas. El agua tiene una alta capacidad calorífica y es el componente más abundante en cualquier solución, así que es suficiente con agua en la celda de referencia.
Cambia el agua cada semana, pero si haces mediciones a alta temperatura, mejor mantenerla fresca.
Entendido, eso tiene sentido.
Profesor, ¿puedo preguntar una cosa más antes de terminar?
Pregunta lo que quieras, no solo uno.
Sobre la concentración al medir muestras, el manual menciona la base en el valor de C, pero no logro imaginarlo claramente.
Acerca del valor de C, sirve para determinar la concentración adecuada de la muestra en la celda para obtener una buena curva sigmoidal en el análisis.
iTC200 incluye software de simulación dentro del software de control, el cual facilita el ajuste de las condiciones.Generalmente, la concentración de proteína suele ser de alrededor de 10 μM, pero depende de la fuerza del enlace.
Si ajustas la concentración basada en el valor de C para interacciones de alta afinidad, la concentración en la celda podría ser muy baja.
Por ejemplo, si el valor de Kd es de 10 nM y quieres ajustar el valor de C a 5, 
Puedes calcular que la concentración de la celda es de 50 nM.
Sin embargo, medirlo a esa concentración podría no producir suficiente señal térmica; al menos 1 μM (nota 3) sería ideal para garantizar la medición.
En las mediciones de ITC, información exacta de concentración es crucial, pero eso lo discutiremos más adelante. Por ahora, determina la concentración de proteína usando espectros de absorción UV alrededor de 280 nm. Vamos a medir realmente: empecemos con una práctica con CaCl2 y EDTA.
(Nota 3) La variación de la señal térmica depende de cada interacción. A veces 1 μM es suficiente, pero si hay poca variación de calor, puede que necesites aumentar la concentración de la celda para la medición.
En el próximo volumen, veremos datos reales, aprenderemos puntos clave para analizar los datos y cómo manejar problemas. ¡Espéralo con ansias!
Mientras escribía este blog, para añadir más realismo, observé una sesión de mediciones ITC bajo la supervisión del Profesor Fukada.
El sistema utilizado era OMEGA, lanzado en 1987. ¡Me sorprendió que este sistema de casi 30 años siga funcionando! Esta es mi primera vez viéndolo en acción. Usaban un PC con Windows 3.1, ¡sin puertos USB! Pero lo que más me impresionó fue que la celda del sistema nunca tuvo fallas, y las únicas reparaciones fueron del motor de agitación y la placa del PC.
El Profesor Fukada comprendía la naturaleza del sistema y había desarrollado métodos propios de uso no incluidos en el manual. Y por supuesto, recomendaba una limpieza exhaustiva después de cada medición.
Usaré las técnicas aprendidas del Profesor Fukada para seguir compartiendo información con todos ustedes.
La historia de MicroCal ITC está en el blog de la sede central de Malvern en UK. ¡Lee más en Material Talks aquí!
