Caractérisation de la taille et de l'état des nanoparticules dans les études nanotoxicologiques et écotoxicologiques grâce à la technique Nanoparticle Tracking Analysis (NTA)

Cette note d'application étudie la façon dont la gamme d'instruments NanoSight utilise la technique Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) pour déterminer l'état des nanoparticules, en particulier leur taille, leur répartition granulométrique et leur concentration dans les milieux d'essai avant des études nanotoxicologiques et écotoxicologiques.

Introduction

La croissance rapide dans le développement et l'utilisation des nanoparticules (NP) artificielles continue d'anticiper la mise au point de méthodes d'évaluation et de gestion des risques qu'elles peuvent poser. Les nouvelles propriétés découlant de la taille des particules à l'échelle nanométrique sont la base des promesses de performance des nanomatériaux. Même lorsque la toxicologie associée au produit sous forme brute est bien comprise, la «lecture croisée» des propriétés pour les mêmes matériaux à l'échelle nanométrique ne peut pas s'effectuer automatiquemnt sur la base d’une hypothèse ; il s'agit essentiellement de nouveaux matériaux. On assiste à une prise de conscience du fait que les effets toxiques sur le long terme et l'impact potentiel de ces matériaux sur l'environnement sont mal compris. Par conséquent, les effets toxicologiques potentiels des nanomatériaux de synthèse suscitent un intérêt et des activités de recherche intenses, ainsi que l’évaluation de l'importance de la fraction des constituants à l’échelle nanométrique dans les produits et les formulations existants.

Avant de commencer toute étude nanotoxicologique, il est impératif de connaître l'état des nanoparticules utilisées, et en particulier leur taille, leur répartition granulométrique et leur concentration dans un milieu d'essai approprié.

La taille des particules détermine leur vitesse de diffusion, la pénétration ou l'exclusion par des barrières biologiques ainsi que les interactions entre particules.

Cette note présente l'application de la technique Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) dans la caractérisation des nanoparticules d'or et leurs agrégats dans un fluide biologiquement intéressant. Venant compléter les techniques de diffusion de la lumière classiques, la technique NTA permet de mesurer et de compter les nanoparticules en suspension particule par particule, offrant ainsi une compréhension plus fine de l'agrégation. L'étude observe le changement de taille des nanoparticules d'or, comparant le cas du dispersant standard (tampon au citrate) avec un plasma dilué contenant des protéines, NIST (2007).

Méthodes et matériaux

Plasma humain :

Du sang a été prélevé sur des donneurs en bonne santé. Les tubes ont été centrifugés pendant 5 minutes à 800 RCF pour disperser les globules rouges et blancs. Le surnageant (plasma) a été transféré dans des tubes étiquetés, stockés à -80 ˚C. Après décongélation, le plasma a été centrifugé à nouveau pendant 3 min à 16,1 kRCF pour réduire davantage la présence de globules rouges et blancs. Les laborantins ont transféré le surnageant dans un nouveau récipient, en prenant soin de ne pas toucher la pastille.

Particules :

Des nanoparticules d'or standard NIST d'un diamètre de 60 nm ont été utilisées (matériel de référence 8013du NIST). Elles ont été stockées, préparées et utilisées en accord avec les rapports d'enquête pertinents, NIST (2007). L'or a été dilué à une concentration d'environ 108 particules/ml à l'aide d'un tampon au citrate standard d'un pH de 7,19. Pour les dispersions dans le plasma, le plasma humain a été dilué à 1:106.d'un tampon citrate standard et 10 µl de nanoparticules d'or ont été dilués avec 790 µl de plasma dilué.

La technique Nanoparticle Tracking Analysis a été mise en oeuvre sur un NanoSight LM10. Toute la préparation et les mesures d'échantillon ont été menées à l’University College de Dublin, en Irlande. Plusieurs vidéos, durant chacune 166 s, ont été enregistrées et analysées à partir de mesures par lots afin d'assurer une invariance statistique. Le plasma étant un milieu ionique naturel, il est connu que l'agrégation des protéines fera toujours partie de la problématique.

Résultats

Des vidéos des nanoparticules ont été enregistrées (Figure 1), suivies et analysées pour déterminer la taille et la concentration lorsqu'elles sont dilué dans un tampon citrate et dans le plasma humain, et corrigées de leur trajet réel (Figure 2).

Figure 1. Image vidéo de particules d'or de 60 nm telles que capturées par l'instrument NanoSight LM10.
MRK1987-01_Fig_1


Figure 2. Résultats NTA présentant les particules dispersées dans un tampon de citrate (bleu) et dans du plasma humain (rouge)
MRK1987-01_Fig_2

Discussion

Les méthodes de mesure de l'or dilué dans un tampon de citrate étaient détaillées dans le rapport des matériaux de référence du NIST (2007). 

La technique NTA peut être utilisée pour déterminer, visuellement et par une mesure de la concentration, que les particules sont toujours monodispersées, ce qui renforce l'hypothèse selon laquelle les protéines en suspension enrobent les nanoparticules (et selon laquelle l'augmentation de la taille n'est pas liée à l'agrégation).

Le changement de taille enregistré dans les Figures 1 et 2 présente une augmentation de la taille des nanoparticules d'environ 10 nm, correspondant à une couche de protéines adsorbées d'une épaisseur de 5 nm recouvrant la nanoparticule.

Conclusions

On constate donc une modification significative et mesurable de la répartition granulométrique de nanoparticules d'or monodisperses en suspension dans un milieu biologique tel que le plasma humain. Le Nanoparticle Tracking Analysis s’avère donc une technique adaptée à la mesure d’une fine épaisseur de protéines adsorbée à la surface de nanoparticules quand elles sont dispersées dans un plasma.

La taille moyenne et la largeur de la distribution de taille des particules d’or dispersées dans un tampon citrate et mesurées par la technique NTA sont semblables à celles déterminées par le NIST. En présence de plasma, la taille des particules et leur répartition granulométrique augmentent de façon similaire.

La technique NTA permet pour mesurer une concentration basée sur le nombre de nanoparticules d'or fournie par le NIST. La technique NTA est également idéale pour identifier et compter les agrégats de nanoparticules tels que les dimères, qui peuvent être différenciés rapidement. Elle représente ainsi (pour les nanoparticules et les régimes de concentration utilisés ici) un outil pratique dans la gamme existante de techniques disponibles pourl a nanobiologie et les interactions sur les nanomatériaux de synthèse en biologie.

Utilisation de la technique NTA dans les études écotoxicologiques et nanotoxicologiques

La technique NTA est reconnue comme une méthode analytique fournissant des informations sur la taille des nanoparticules et de façon non moins importante, sur leur concentration. Elle permet également d'arriver à de tels résultats avec des types d'échantillons complexes et de grande polydispersité (Montes-Burgos et al., 2010; Lynch, 2008; Montes-Burgos et al., 2007). Les méthodes telles que le NTA peuvent être considérées comme l'un des moyens grâce auxquels l'impact environnemental et la toxicité cellulaire potentielle des nanoparticules pourront être étudiés à l'avenir (Borm et al., 2006; Tenuta, 2008; Tran and Anton, 2009; Kuhlbusch et al., 2010; Hassellöv and Kaegi, 2009; Stolpe et al., 2011).

De récentes études ont démontré l'infinie complexité des interactions entre les nanoparticules et les matrices environnementales, interactions qui représentent un défi important dans leur quantification et leur modélisation, mais la technique NTA peut offrir un mécanisme d'enquête et d'analyse (Gornati et al., 2009; Hartmann, 2011; Arvidsson et al., 2011; Howard, 2010; Njuguna et al., 2011; Tran et al., 2009).

Dans une étude des effets d'un enrobage appliqué à une nanoparticule de fer à valence nulle (nZVI) lors des premiers stades du cycle biologique de trois espèces invertébrées marines clés, Kadar et al. (2012) ont utilisé la technique NTA pour étudier la dissolution du nZVI dans l'eau de mer, démontrant que l'enrobage a permis de stabiliser la suspension des nanoparticules de métal. Kadar a également étudié par la technique NTA, l'effet de nanoparticules de fer artificielles pertinentes sur le plan industriel, sur la croissance et le métabolisme de cultures de microalgues marines. Il a décrit les altérations conséquentes de leur croissance, de leur répartition granulométrique, de leur profils de lipidiques et de leur structure cellulaire (Kadar et al., 2012)

En utilisant des puces à oligonucléotides 15k pour le Daphnia magna, un crustacé d'eau douce qui est une espèce indicatrice répandue pour l'évaluation de la toxicité, afin de différencier la toxicité spécifique des particules et des ions argent et de développer des biomarqueurs d'exposition pour les nanoparticules d'argent enrobées de citrate et enrobées de polyvinylpyrrolidone, Poynton et al. (2012) ont déterminé le degré d'agrégation des nanoparticules d'argent par la technique NTA avant d'étudier leur toxicité au niveau génomique.

En étudiant la toxicité des nanoparticules d'oxyde de zinc sur l'espèce Folsomia candida, Waalewijn-Kool et al. (2012) ont démontré que les différentes méthodes d'enrichissement de milieux d'exposition visant à tester les caractéristiques de répartition granulométrique, n'ont pas changé grand-chose à la capacité reproductrice de l'organisme, les techniques NTA et TEM indiquant toutes deux que la toxicité de l'oxyde de zinc n'était pas liée à la taille des particules.

Au niveau cellulaire, la technique NTA s'est avérée utile pour l'étude de la génotoxicité des nanoparticules de cobalt dans les leucocytes périphériques humains (Colognato et al., 2008) et les fibroblastes de souris (Ponti et al., 2009). Ce document montre la capacité des nanoparticules à traverser le placenta humain (Wick et al., 2009) et décrit les méthodes visant à étudier leurs effets sur d'autres barrières biologiques (Linn et al., 2010), notamment le transport des nanoparticules de silice dans la peau humaine (Staroňová et al., 2012). Similarly, Filon et al. (2012) ont rédigé un rapport sur la pénétration des nanoparticules de cobalt dans la peau humaine intacte et endommagée, suggérant que le cobalt appliqué en tant que nanoparticule peut pénétrer la peau humaine dans un système de diffusion in vitro.

La compréhension de la répartition granulométrique des nanoparticules avant leur introduction dans les systèmes cellulaires pour des tests cytotoxicologiques est cruciale. La technique NTA s'est révélée utile à cet égard (Kendall et al., 2009; Patel et al., 2010; Munaro, 2010; Karlsson, 2010). Les interactions chimiques de nanoparticules de types différents avec diverses matrices d'origine biologique telles que le sérum (Treuel et al., 2010), les polluants organiques (Ben-Moshe et al., 2009) et le dithiothréitol (Sauvain et al., 2008) ont également été étudiées.

Les effets toxicologiques des agrégats de nanoparticules de cobalt (Co-NP) ont été examinés et comparés à ceux des ions de cobalt grâce à différentes lignées cellulaires représentant le poumon, le foie, le rein, les intestins et le système immunitaire. Les conclusions générales correspondaient à l'hypothèse selon laquelle les effets toxiques des nanoparticules de cobalt agrégées sont principalement dus à la dissolution d'ions de cobalt des nanoparticules agrégées. (Limor et al., 2011).

Références

Arvidsson R, Molander S, Sanden BA and Hassellov M (2011) Challenges in Exposure Modeling of Nanoparticles in Aquatic Environments, Human and Ecological Risk Assessment: An International Journal, Volume 17, Édition 1, 2011, Pages 245 - 262, DOI: 10.1080/10807039.2011.538639

Ben-Moshe T, Dror I and Berkowitz B (2009) Oxidation of organic pollutants in aqueous solutions by nanosized copper oxide catalysts, Applied Catalysis B: Environmental, Volume 85, Éditions 3-4, Pages 207-211 

Borm P, Klaessig FC, Landry TD, Moudgil B, Pauluhn J, Thomas K, Trottier R and Wood S (2006) Research Strategies for Safety Evaluation of Nanomaterials, Part V: Role of Dissolution in Biological Fate and Effects of Nanoscale Particles, Toxicological Sciences, 90 (1): 23-32 

Colognato R, Bonelli A, Ponti J, Farina M, Bergamaschi E, Sabbioni E and Migliore L (2008) Comparative genotoxicity of cobalt nanoparticles and ions on human peripheral leukocytes in vitro, Mutagenesis Advance Access, publié en ligne le 25 mai 2008. and Mutagenesis 2008 23(5):377-382

Filon FL, Crosera M, Timeus E, Adami G, Bovenzi M, Ponti J, Maina G (2012) Human Skin Penetration of Cobalt Nanoparticles Through Intact and Damaged Skin, Toxicology in vitro, http://dx.doi.org/10.1016/j.tiv.2012.09.007,

Gornati R, Papis E, Di Gioacchino M, Sabbioni E, Dalle-Donne I, Milzani A and Bernardini G (2009) In vivo and in vitro Models for Nanotoxicology Testing, in Nanotoxicity (eds S. C. Sahu and D. A Casciano), John Wiley & Sons, Ltd, Chichester, UK. DOI: 10,1002/9780470747803.ch15

Hartmann NB (2011) Ecotoxicity of engineered nanoparticles to freshwater organisms, Thèse de doctorat Avril 2011, Department of Environmental Engineering, Université technique du Danemark

Hassellöv M and Kaegi R (2009) Analysis and characterization of Manufactured Nanoparticles in Aquatic Environments. Dans : « Nanoscience and Nanotechnology: Environmental and human health implications. » (Eds. Lead J.R. and Smith E.) Wiley Interscience, Chapitre 6, p. 211-266.

Howard AG (2010) On the challenge of quantifying man-made nanoparticles in the aquatic environment, J. Environmental Monitoring, 12, 135 - 142. DOI: 10,1039/b913681a

Kadar E, Rooks P, Lakey C, Whitea DA (2012) The effect of engineered iron nanoparticles on growth and metabolic status of marine microalgae cultures, Science of The Total Environment, Volume 439, 15 novembre 2012, Pages 8-17

Karlsson HL (2010) The comet assay in nanotoxicology research, Analytical and Bioanalytical Chemistry DOI: 10,1007/s00216-010-3977-0

Kendall M, Ding P, Kendall K and Clark H (2009) Nanotoxicology of PM: Particle interactions with lung surfactant polymers, IEH (2009) Proceedings of the Annual UK Review Meeting on Outdoor and Indoor Air Pollution Research, 20-21 April 2009 (Web Report W26), Institute of Environment and Health, Université de Cranfield, Royaume-Uni, disponible à l'adresse suivante : http://www.cranfield.ac.uk/health/ieh

Kuhlbusch TAJ, Fissan H and Asbach C (2010) Measurement and Detection of Nanoparticles within the Environment. Nanotechnology. p. 229-266

Limor H-A, James KC., Rafi K, Patrice NM, Oded M, Ponti J, Romano R, Rossi F, Golla-Schindler U, Sommer D, Uboldi C, Unger R and Villiers C (2011) Predictive toxicology of cobalt nanoparticles and ions: comparative in vitro study of different cellular models using methods of knowledge discovery from data, Toxicol. Sci. (2011) DOI: 10.1093/toxsci/kfr124 Première publication en ligne : 20 mai 2011

Linn M, Loretz B, Philippi C, Vajda V (2010) Optical characterization of nanoparticles, 8th International Conference and Workshop on Biological Barriers - in vitro Tools, Nanotoxicology, and Nanomedicine, 21 mars - 1 avril 2010, Université de Saarland, Saarbrücken, Allemagne

Lynch I (2008), NanoInteract - dispersion, cell culture standards, protocols, NanoImpactNet WP1 Workshop, UCD, Irlande, 20 juin 2008.

Montes-Burgos I, Salvati A, Lynch I, Dawson K (2007), Characterization techniques for nanoparticle dispersion, at European Science Foundation (ESF) Research Conference on Probing Interactions between Nanoparticles/Biomaterials and Biological Systems, Sant Feliu de Guixols, Espagne, 3 - 8 novembre 2007

Montes-Burgos I, Walczyk D, Hole P, Smith J, Lynch I and Dawson K (2010) Characterization of Nanoparticle Size and State Prior to Nanotoxicological Studies, Journal of Nanoparticle Research, Volume 12, numéro 1 / janvier 2010 DOI: 10.1007/s11051-009-9774-z

Munaro B (2010) Mechanistic in vitro tests for genotoxicity and carcinogenicity of heavy metals and their nanoparticles, Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades des Doktors der Naturwissenschaften Eingereicht im Fachbereich Biologie an der Universität Konstanz vorgelegt von June 2009 Konstanzer Online-Publikations-System (KOPS) URN: http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:352-opus-121714

National Institute of Standards & Technology, Report of Investigation, Reference Material 8013, Gold Nanoparticles, Nominal 60 nm Diameter 13/12/2007.

Njuguna J, Sachse S, Silva F, Irfan A, Michałowski S, Pielichowski K, Kazmina O, Ermini V, Zhu H and Blázquez M (2011) Investigations into nanoparticles generated from nanofiller reinforced polymer nanocomposites during structural testing, Safety issues of nanomaterials along their life cycle, Symposium at LEITAT Technological Center, Barcelone (Espagne). 4 et 5 mai 2011

Patel D, Kell A, Simard B, Xiang B, Lin HY and Tian G (2010) The cell labeling efficacy, cytotoxicity and relaxivity of copper-activated MRI/PET imaging contrast agents, Biomaterials, DOI:10.1016/j.biomaterials.2010.10.013

Ponti J, Sabbioni E, Munaro B, Broggi F, Marmorato P, Franchini F, Colognato R and Rossi F (2009) Genotoxicity and morphological transformation induced by cobalt nanoparticles and cobalt chloride: an in vitro study in Balb/3T3 mouse fibroblasts, Mutagenesis, Jul 2009; DOI:10,1093/mutage/gep027

Poynton HC, Lazorchak JM, Impellitteri CA, Blalock BJ, Rogers K, Allen J, Loguinov AV, Heckman L and Govindasmawy S (2012) Toxicogenomic Responses of Nanotoxicity in Daphnia magna Exposed to Silver Nitrate and Coated Silver Nanoparticles, Environ. Sci. Technol., DOI: 10.1021/es3001618

Sauvain J, Deslarzes S and Riediker M (2008) Nanoparticle reactivity toward dithiothreitol, Nanotoxicology, 2:3, 121 - 129

Staroňová K, Nielsen JB, Roursgaard MJ, Knudsen LE (2012) Transport of SiO2 Nanoparticles through Human Skin, Basic & Clinical Pharmacology & Toxicology, DOI: 10,1111/j.1742-7843,2012.00873.x

Stolpe B, Lead J, Cole P, Kendall M, Kadar E, Poole J, Whitby C, Colbeck I, Fabrega J and Galloway T (2011) Multimethod characterization of manufactured nanoparticles in toxicity studies, 6th International Conference on the Environmental Effects of Nanoparticles and Nanomaterials, N1.7,The Royal Society, Londres, 19-21 septembre 2011.

Tenuta T (2008) A Systematic Approach to Assessing Potential Environmental Impacts of Nanomaterials: Nanoparticle Synthesis, Characterization and Impact Assessment, , EPA Scholarship & Fellowship Seminar - 13 novembre 2008, Hôtel Hilton Kilmainham, Dublin 8, Irlande

Tran L and Antón JMN (2009) Nanotoxicology And Engineered Nanoparticle Risk Assessment, Seguridad y Medio Ambiente - Nº 114, p. 1 sur 45

Treuel L, Malissek M, Gebauer JS and Zellner R (2010) The Influence of Surface Composition of Nanoparticles on their Interactions with Serum Albumin, Chem Phys Chem, Volume 11, édition 14, pages 3 093-3 099

Waalewijn-Kool PL, Ortiz MD and van Gestel CAM (2012) Effect of different spiking procedures on the distribution and toxicity of ZnO nanoparticles in soil, Ecotoxicology. DOI: 10.1007/s10646-012-0914-3Online First™Open Access

Wick P, Malek A, Manser P, Meili D, Maeder-Althaus X, Diener L, Diener P-A, Zisch A, Krug H F. and von Mandach U (2009) Barrier Capacity of Human Placenta for Nanosized Materials, Environmental Health Perspectives DOI: 10.1289/ehp.0901200, (available at http://dx.doi.org/) En ligne le 12 novembre 2009

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