Applications diverses du MicroCal Auto-iTC200 de Malvern dans une campagne de recherche de médicament basée sur des fragments moléculaires

Introduction

Ces travaux décrivent dans les grandes lignes une approche de type « fragment-based drug discovery » (FBDD) (recherche de médicament basée sur des fragments moléculaires) pour l'identification et l'optimisation de leads susceptibles d'inhiber l'activité de la phosphatidylinositol 3-kinase (Vps34). Il a été montré que cette kinase joue un rôle important dans la résistance aux médicaments anticancéreux (1, 2). La Vps34 est au centre de l'activation de l'autophagie et a pour cette raison été identifiée comme une cible d'intervention thérapeutique. L'autophagie, ou autophagocytose, est un processus catabolique impliquant une dégradation des composants cellulaires à travers la machinerie lysosomale et est identifiée comme un mécanisme important de la carcinogenèse.

Le MicroCal Auto-iTC200 a joué un rôle central dans cette campagne, essentiellement du fait du nombre minime d'étapes nécessaires à la préparation des protéines cibles, et pour la simplicité de la mise au point du test. Les données du MicroCal Auto-iTC200 ont été utilisées pour valider des hits issus d'un criblage primaire basé sur la variation de température de dénaturation et pour classer avec précision les affinités du fragment afin que seuls les meilleurs ligands passent aux essais de co-cristallisation et au programme de recherche basé sur la structure. La pertinence de cette approche pour prédire avec exactitude les hits susceptibles de former des complexes co-cristallins avec la cible a été démontrée puisque 12 des 14 complexes de protéine choisis suite à la validation par titration calorimétrique isotherme (ITC) ont effectivement été cristallisés. L'instrument a également été utilisé pour évaluer la réussite des itérations d'optimisation qui ont suivi dans le programme de chimie médicinale basée sur la structure.

Fig 1. Vue d'ensemble du processus d'une campagne FBDD. Une bibliothèque de fragments a été criblée par mesure de la variation de température de dénaturation (thermal shift assay - TSA). Les fragments hits identifiés ont été validés à l'aide du MicroCal Auto-iTC200. La stabilité thermique de la protéine cible et les effets stabilisateurs des hits ont été analysés et validés à l'aide du MicroCal VP-Capillary DSC. Les hits confirmés par ITC ont été co-cristallisées. Un cycle d'optimisation comprenant : de la chimie médicinale, une caractérisation des hits avec le MicroCal Auto-iTC200, et une co-cristallisation, a conduit à un jeu de séries chimiques. La DSC a été utilisée pour caractériser la stabilité de la protéine cible et pour valider certaines données de variation de la température.

Matériels et méthodes

Les protéines et les fragments ont été fournis par Sprint Bioscience (Stockholm, Suède). Le MicroCal Auto-iTC200 et le MicroCal VP-Capillary DSC sont disponibles auprès de Malvern Instruments. Toutes les expériences ont été réalisées à 25 °C.

La cellule de mesure du MicroCal Auto-iTC200 a été remplie avec 20 mM de Tris pH 7,5, 300 mM de NaCl, 10 % de glycérol, 0,5 mM de TCEP, et 2 % ou 5 % de DMSO. Les fragments jugés comme des ligands faibles (K_D > 10 µM) ont été injectés à une concentration de 4 mM pour une concentration en protéine de 50 µM. Les ligands plus forts ont été injectés à une concentration de 200 µM, pour une concentration en protéine de 20 µM. Chaque volume d'injection était de 3 µl, pour 12 injections, avec un temps d'injection de 6 s, et un délai de 150 s entre les injections. Chaque expérience durait environ 20 minutes au total. La plage de masse moléculaire des fragments était de 149 à 333 Da. Le MicroCal VP-Capillary DSC a été utilisé pour évaluer la stabilité thermique de la protéine cible dans le tampon de dosage en l'absence et en la présence d'une sélection de fragments. Pour les analyses de DSC la concentration en protéine était de 0,2 mg/ml et la concentration du fragment, de 1 mM. La rampe de température était de 60 °C/h.

Criblage primaire

Une bibliothèque d'environ 500 fragments a été criblée pour la Vps34 à travers une mesure du décalage de température de dénaturation, la protéine étant chauffée en l'absence et en présence de chacun des fragments à une concentration de 1 mM. Le processus de dénaturation de la protéine a été étudié par fluorimétrie différentielle à balayage (DSF). L'objectif était d'identifier des ligands susceptibles de co-cristalliser afin de réunir des informations structurales pour les processus de génération et d'optimisation des leads.

Du fait des problèmes d'instabilité de la protéine survenus lors des tentatives de développer un dosage de liaison nécessitant l'immobilisation de la protéine, le MicroCal Auto-iTC200 s'est avéré particulièrement bien adapté à ce projet. L'ITC a été choisie comme méthode de validation de hit, en premier lieu car elle ne nécessite que peu d'étapes de préparation, ce qui réduit le risque de dégradation de la protéine. L'utilisation du MicroCal AutoiTC200 a permis de réaliser les analyses facilement et rapidement dans un tampon visqueux contenant du glycérol. Une caractérisation basique de la stabilité de la protéine avec le MicroCal VP-Capillary DSC a montré de légers problèmes de stabilité thermique (Tm=50 °C dans le tampon de dosage avec 4 % de DMSO). La DSC a confirmé les effets stabilisateurs de deux fragments hits identifiées par TSA. L'ITC a permis de confirmer que l'un des fragments identifiés lors de ces travaux était un ligand, et celui-ci a produit une structure co-cristalline, mais il a conduit à un décalage négatif lors d'une expérience de DSF. Une caractérisation plus poussée de ce fragment, par DSC, a montré qu'il stabilise la protéine cible. Ceci montre bien l'importance de l'utilisation complémentaire des dosages de stabilité thermique, et la possibilité qu'ils offrent d'identifier des ligands également parmi les fragments ayant conduit à un décalage négatif lors du criblage primaire par DSF.

Un suivi des hits issus du criblage primaire a été réalisé à travers des études de décalage thermique en fonction de la dose (fig 2). La mesure du décalage thermique et le dosage ITC nécessitent une grande solubilité des fragments. Une chute dans la courbe de réponse en fonction de la dose reflète une solubilité limitée du hit et ces fragments doivent être exclus de la suite de l'étude. Les fragments ayant permis de générer une courbe de dose-effet ont ensuite été validés par un dosage secondaire à l'aide du MicroCal Auto-iTC200.

Fig 2. Exemple de tracé de dose-effet pour deux expériences de variation de température. Le décalage de Tm est porté en fonction de la concentration du fragment. Le fragment SB002-41 montre une chute dans la courbe du fait de la solubilité limitée, et a par conséquent été exclu de la suite de l'étude.

Validation de hit à l'aide du MicroCal Auto-iTC200

Le MicroCal Auto-iTC200 s'est avéré être une méthode de choix pour la validation des hits, en particulier car elle ne nécessite qu'un nombre minimal d'étapes de préparation de la protéine, ce qui réduit d'autant le risque d'inactivation.

La calorimétrie de titration isotherme mesure la variation de température qui accompagne le passage d'un état libre à un état lié de plusieurs molécules en interaction. L'isotherme qui résulte de ces mesures est ajustée sur un modèle de liaison pour en déduire l'affinité (K_D), la stœchiométrie (n) et l'enthalpie (ΔH) de l'interaction. Dans cette étude, les affinités ont été utilisées pour classer les fragments afin de sélectionner les ligands les plus forts pour la cristallisation.

Parmi les 47 fragments sélectionnés suite au criblage par TSA, 33 ont donné de bons résultats de liaison, utilisables pour quantifier l'affinité et 14 ont montré soit aucune chaleur de liaison, soit des isothermes inhabituelles (fig 3). L'étude des données brutes du MicroCal Auto-iTC200 a permis une identification et une élimination précoces des faux positifs parmi les hits issus de l'analyse par TSA. Les 33 fragments prometteurs ont été classés par ordre d'affinité et les 20 ligands les plus forts ont fait l'objet d'un nouveau criblage afin d'évaluer la solidité de la détermination de l'affinité. Les données du premier et du second criblage montrent une reproductibilité raisonnable (fig 4) malgré la faiblesse des ligands et le fait que deux lots de protéine différents ont été testés.

Fig 3. Exemples de fragments analysés avec le MicroCal Auto-iTC200. Les graphiques de gauche et du centre montrent les données brutes (panneaux supérieurs) et les isothermes de liaison (panneaux inférieurs) d'un fragment ayant une affinité d'environ (A) 0,9 mM et (B) 4 µM. Parmi ces composés, le ligand le plus fort a été sélectionné pour une étude plus poussée. Les données du fragment de faible affinité (A) sont un exemple de titration à faible concentration, dans lequel une protéine dont la concentration est inférieure à K_D est titrée avec un grand excès d'un composé (3). (C) montre les données brutes d'un fragment ayant été rejeté à cause de son isotherme inhabituelle. Les pics sont larges et ne reviennent pas à la ligne de base avant l'injection suivante. Ceci indique un événement lent, soit un processus d'agrégation lent (induit par le ligand), soit une dissociation lente du ligand. Ce dernier comportement peut s'expliquer par une agrégation des petites molécules aux fortes concentrations dans la seringue, puis par une dissociation lors de la dilution. Il n'y a aucune indication claire de liaison et quelques indices de comportement inhabituel, qui font penser qu'il s'agit d'un faux positif passé à travers le criblage primaire. (D) montre les données brutes d'un fragment présentant un comportement exothermique lors des deux premières injections puis un comportement endothermique lors des injections suivantes. Ce comportement complexe peut être dû à un faux positif, et le composé a été exclu de la suite de l'étude.

Fig 4. Robustesse des mesures d'affinité des fragments. Deux mesures réalisées sur une même protéine ont été confrontées afin d'évaluer la reproductibilité des déterminations d'affinité.

Sur la base de ces données, 14 fragments ont été choisis pour une détermination de la structure co-cristalline. Parmi ceux-ci, 12 ont donné satisfaction (fig 5), démontrant ainsi l'utilité du MicroCal Auto-iTC200 en tant qu'indicateur fiable de la possibilité de détermination des structures co-cristallines protéine-ligand, et comme outil permettant de faire progresser des fragments sur la voie du développement chimique.

Fig 5. Structure cristalline d'un fragment lié à Vps34.

Génération de leads

Les 47 hits soumis au criblage secondaire représentaient cinq séries chimiques différentes. Les meilleurs ligands identifiés lors du criblage secondaire provenaient de deux de ces séries, et ont été encore optimisés à travers un programme de chimie médicinale. L'itération suivante des composés contenait des éléments des deux séries et a été validée à l'aide du MicroCal Auto-iTC200 pour une liaison avec la protéine cible (fig 6). Les affinités de liaison avec la protéine cible de la seconde génération de fragments étaient significativement améliorées, ce qui démontre l'a pertinence de l'ITC en tant que dosage permettant de révéler la relation structure-activité (SAR).

Fig 6. Exemple de recombinaison de deux séries chimiques à partir des ligands les plus forts. Lors de l'itération suivante, les mesures par ITC ont montré une amélioration de l'affinité.

Conclusions

Le MicroCal Auto-iTC200 a été intégré avec succès à un processus de recherche de médicament pour la campagne d'identification de fragments décrite ici. L'instrument a l'avantage de ne nécessiter qu'un développement de test minimal et très peu de préparation d'échantillon, pour un processus fluide apportant des résultats cohérents et fiables. Son utilisation comme outil de criblage secondaire a été une réussite puisqu'il a permis de valider des hits pour des protéines présentant une stabilité limitée dans d'autres dosages complémentaires. Les données du système ont permis une identification et une élimination précoces des faux positifs produits par le criblage primaire et la technique s'est également avérée être un indicateur fiable de la possibilité de détermination des structures co-cristallines protéine-ligand.

En résumé, l'ITC et un dosage reposant sur la relation structure-activité qui fournit des valeurs de K_D, lesquelles peuvent être utilisées pour prioriser des séries de fragments et pour orienter le développement des itérations suivantes dans le cadre d'un processus de recherche de médicament. Conçu dans un souci de simplicité d'utilisation et de sensibilité exceptionnelle, le MicroCal Auto-iTC200, entièrement automatisé, est un outil de grande valeur pour ce type de recherche.

Remerciements

Les protéines et les fragments ainsi que les données des premiers dosages par TSA et les études par rayons X ont été aimablement fournis par Sprint Bioscience.

Sprint Bioscience est une entreprise de recherche de médicament qui bâti un portefeuille de projets innovants orientés sur l'oncologie, centrés sur le métabolisme du cancer. Grâce à sa plate-forme de découverte de médicaments sur la base de fragments, Sprint Bioscience peut rapidement identifier des molécules aux propriétés appropriées pour le développement d'un médicament. Ces molécules servent de base aux programmes de recherche de médicament. Selon un processus itératif englobant la science des protéines, un criblage des fragments, la chimie médicinale, la cristallographie par rayons X, et des études biologies pertinentes Sprint Bioscience modifie les molécules pour créer des médicaments candidats prêts à entrer en développement. De plus, Sprint Bioscience propose des services de recherche sous contrat donnant accès à ses connaissances internes et à sa plate-forme de technologies.

Références

1. Funderburk, S.F. et al. The Beclin 1-VPS34 complex – at the crossroads of autophagy and beyond. Trends Cell Biol. 20, 355-362 (2010)
2. Yang, S. et al. Pancreatic cancers require autophagy for tumor growth. Gene. Dev. 25, 717-729 (2011)
3. Tumbull, B.W and Daranas, A.H. On the value of c: Can low affinity systems be studied by isothermal titration calorimetry? J. Am. Chem. Soc. 125, 14859-14866 (2003)