Mesure haute résolution de taille et de concentration d'agrégats de protéines, dans le domaine du sub-visible.

Introduction L'agrégation de protéines peut se produire à toutes les étapes du processus de fabrication (culture de cellules, purification, formulation), de stockage, de distribution et de manipulation des produits. Elle résulte de différents types de stress, tels que l'agitation et l'exposition à des niveaux extrêmes de pH, de température, de force ionique ou de différentes interfaces (par ex. interface entre l'air et le liquide). Des concentrations élevées en protéines (comme dans certaines formulations biothérapeutiques) peuvent augmenter la probabilité d'agrégation.

Une large variété d'agrégats peuvent être présent dans les échantillons biopharmaceutiques, avec différentes tailles et caractéristiques (soluble, insoluble, covalent, non covalent, réversible, irréversible). Les agrégats de protéines peuvent se distribuer dans une large gamme de tailles, des petits oligomères (de quelques nanomètres) aux agrégats insolubles de l'ordre du micron qui peuvent contenir des millions d'unités monomères.

L'agrégation doit être soigneusement caractérisée et contrôlée au cours du développement, de la fabrication et du stockage d'un produit formulé. De même, la suivi de l'état de l'agrégation peut permettre de modifier ou d'optimiser le processus de production.

Analyse du suivi individuel de particules (NTA, Nanoparticle Tracking Analysis) L'analyse du suivi individuel de particules (NTA) est une méthode de visualisation et d'analyse des particules dans les liquides, qui associe la vitesse du mouvement Brownien à la taille des particules (Figure 1). La vitesse de mouvement est associée uniquement à la viscosité du liquide, à la température et à la taille des particules. Elle génère une distribution de tailles de particules haute résolution en mesurant chaque particule individuellement et en donnant la concentration des particules présentes dans l'échantillon (Figure 2). En raison de l'index de réfraction faible de la protéine, la limite inférieure de détection de la mesure NTA est d'environ 30 nm de diamètre. Cela signifie que les unités monomères de protéines, qui mesurent généralement entre 3 et 10 nm, ne sont pas mesurables par la technique NTA. En revanche, les agrégats composés de quelques dizaines de monomères à plusieurs milliers d'unités peuvent être mesurés et comptés. Étant donné qu'il n'est généralement pas nécessaire de diluer l'échantillon pour obtenir la distribution de tailles de particules, le profil d'agrégation n'est pas modifié suite au traitement de l'échantillon.

Figure 1. Une image typique produite par la technique NTA. L'image permet aux utilisateurs de déterminer instantanément certaines caractéristiques de leur échantillon et la présence d'agrégats. Figure 2. Distribution de tailles de particules (distribution en nombre) issue de l'échantillon présenté dans la Figure 1. Exemple 1 - Stress par agitation Dans l'exemple suivant, un virus a été correctement mesuré par la technique NTA à un diamètre de 45 nm (Figure 3a). Cependant, après agitation de quelques secondes (par simple secouage), la contrainte de cisaillement a produit une agrégation de ce même échantillon de virus (Figure 3b).

Figure 3. Profil de distribution de tailles de particules d'un échantillon de virus a) avant et b) après l'agrégation causée par la un stress par agitation. Notez que le changement d'échelle dans l'axe vertical normalisé présente une chute de concentration des particules agrégées (de 80*10 7 particules/mL à 50*10 7 particules/mL environ). D'après : Moser M., (2008) Emerging analytical techniques to characterize vaccines, Proc. Intl. Conf. Vaccines Europe, Bruxelles, décembre 2008.

Exemple 2 - Stress thermique Dans cet exemple, une solution d'IgG (1mg/mL) a été chauffé à 50 o C. Au cours de cette cinétique, on observe que les particules diffusant de la lumière augmentent en nombre et en intensité (dispositif NS500 équipé d'un laser 638nm). A chaque checkpoint de cette cinétique d'agrégation, des mesures ont été réalisées par NTA et également DLS (Dynamic Light Scattering). Les données révèlent la présence de monomères et aussi des agrégats. Après 20 minutes d'agrégations induite thermiquement, les données de DLS montrent un pic de monomères avec un diamètre hydrodynamique équivalent à une sphère de 10nm. En complément, la technique NTA a mesuré des particules d'agrégats d'environ 30nm, avec des pics observés à 50 et 85nm, jusqu'aux plus gros agrégats mesurant 300nm environ. La technique NTA donne également la concentration des particules. L'augmentation en nombre de particules au cours de l'agrégation a doncc pu être suivie (Figure 5). Ces données suggèrent que pendant les trente premières minutes, il existe des agrégats minimes d'une taille supérieure à 30 nm. De 30 à 100 minutes, le nombre d'agrégats mesurant 30 nm ou plus reste stable. Après 100 minutes, le nombre d'agrégats semble augmenter de manière plus exponentielle. L'utilisation des données de taille des techniques NTA et DLS et des données de concentration NTA du même échantillon offrent une solution riche en informations pour les analyses dans le domaine complexe des agrégats de protéines.

Figure 4. Agrégation d'IgG dans le temps Figure 5. Agrégation d'IgG dans le temps telle que mesurée avec NTA. Exemple 3 - Échantillons à concentration élevée Les techniques de production de protéines peuvent générer des lots aux concentrations supérieures à 150mg/mL Des échantillons BSA de 50 mg/mL, 100 mg/mL et 150 mg/mL ont été injectés dans la chambre à échantillon. On observe que le bruit de fond, provenant de la diffusion des monomères (trop petits pour être résolus) augment en fonction de la concentration de l'échantillon. Cependant, NTA peut toujours identifier et suivre les agrégats d'un diamètre d'environ 40nm minimum (Figure 6).

Figure 6. Images vidéo NTA et profils de distribution de tailles pour échantillons BSA de 50 mg/mL, 100 mg/mL et 150 mg/mL. Exemples de documentation récents NTA a également été utilisé dans des études sur l'influence de la concentration en sulfate d'ammonium sur la taille et la distribution de taille (répartie en 3 phases) de l'α-chymotrypsin (Rather et al. , Plos ONE, 2012) 7(12) : e49241. doi : 10,1371/journal. pone.00492410).

Torosantucci et al. ont étudié l'effet de différents antioxydants sur l'agrégation de l'insuline induite par le cuivre/acide ascorbique, en utilisant NTA pour générer des profils de distribution de taille par rapport à l'état non agrégé (Torosantucci et al. , Eur J Pharm Biopharm. août 2013 ; 84(3) :464-71. doi : 10.1016/j.ejpb.2013.01.011. Epub 9 fév. 2013).

Conclusion Dans le but de prévenir la formation de gros agrégats protéiques rendant les formulations thérapeutiques inadaptées pour les patients, les équipes scientifiques doivent comprendre à quels moments critiques des processus de synthèse, purification, emballage, transport, stockage ou d'utilisation, les unités monomériques de protéines commencent à s'agréger. En effectuant des mesures de distribution de tailles avec les techniques NTA et DLS à différents points du processus, les scientifiques peuvent identifier le processus durant lequel l'agrégation commence. Ce processus peut ensuite être révisé, modifié ou optimisé pour empêcher ou réduire la formation d'agrégats de protéines.

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