Température d’agrégation (Tagg) – qu’est-ce que c’est, et comment peut-on la calculer ?

Mesurer la température d’agrégation à l’aide du Zetasizer

En diffusion de lumière dynamique (DLS), la taille hydrodynamique et la distribution de taille des particules en solution peuvent être obtenues. Il peut être intéressant d’examiner cette mesure en fonction du temps et de la température, ou comme une « tendance », comme on l’appelle dans le logiciel Zetasizer de Malvern. Pour des échantillons de protéines biologiques, cette tendance de température est particulièrement intéressante : bien qu’à basse température une protéine puisse être stable et montrer des mesures de taille (et d’intensité de diffusion) répétables, typiquement à une certaine température élevée (T_agg), les molécules de protéines auront tendance à s’oligomériser ou à s’agréger. La température à laquelle cela se produit dépendra de la protéine elle-même, en plus de la composition du tampon, et elle n’est généralement observable clairement que lorsque la protéine de départ est homogène au début de la mesure.

Un exemple, discutant de la stabilité de l’albumine humaine recombinante, est abordé dans la note d’application, « Utilisation de la diffusion de lumière pour étudier la stabilité thermique de la Recombumine – prédire la durée de conservation« .

Comment T_agg est-elle déterminée ?

La méthode traditionnelle pour déterminer la température d’agrégation T_agg était d’examiner l’intensité normalisée en fonction de la température. Le point d’agrégation était le premier point où la pente était supérieure à 10, où la pente inclut les 5 points de données précédents. Cette méthode pouvait être modifiée pour examiner la taille z-moyenne, voire l’indice de polydispersité. Le logiciel actuel contient deux algorithmes de régression :

• Analyse à un seul paramètre (taux de comptage uniquement)
• Analyse à plusieurs paramètres (taille et taux de comptage)

L’ajustement à plusieurs paramètres prend en considération à la fois le changement de taille hydrodynamique (z-moyenne) et le taux de comptage (dérivé) de diffusion et est la méthode préférée. Une capture d’écran du logiciel actuel montre une différence typique entre les deux méthodes d’analyse.

Par exemple, pour le point de température d’agrégation de l’hémoglobine fourni dans le fichier Example Results.dts, l’ancienne méthode à paramètre unique a donné un résultat de 38 °C, tandis que la nouvelle méthode à plusieurs paramètres a donné un résultat de 42 °C. Le changement absolu n’est pas trop préoccupant, tant que la même méthode est utilisée pour comparer différents ensembles de données. Pour voir ce menu pour tout ensemble de données, sélectionnez un enregistrement, faites un clic droit et sélectionnez « éditer le résultat ».

Pourquoi T_agg est-elle différente de T_melt ?

La température d’agrégation détecte le début de l’agrégation ; la température à laquelle les molécules ont tendance à s’agréger. La température de fusion, T_melt ou T_m, en revanche, est le résultat de la dénaturation (presque) complète de la protéine. Elle peut, par exemple, être déterminée par calorimétrie à balayage différentiel (DSC) ou par dichroïsme circulaire (CD), qui peuvent respectivement détecter de petits changements de capacité thermique et de structure globale. En raison de l’extrême sensibilité de la diffusion de lumière aux petits changements de taille moléculaire et au début de l’oligomérisation, la température d’agrégation (T_agg) est généralement inférieure à la température de fusion (T_melt).

Comment configurer une mesure pour T_agg ?

Le Zetasizer permet des mesures de tendance automatisées en fonction de la température. Pour accéder au menu, soit démarrer une mesure manuelle, soit créer un SOP. Puis sélectionnez dans le coin supérieur gauche de la fenêtre Type de Mesure – Tendance – Température – Taille qui démarrera avec certains paramètres par défaut. Parcourez les éléments du menu, en particulier la séquence de tendance, où la température de début et fin ainsi que l’intervalle de température peuvent être renseignés. Cochez la case « vérifier le point d’agrégation ». Dans les paramètres « Mesure de taille », fournissez le temps d’équilibrage à chaque étape. Je recommande de cocher la case « permettre de sauvegarder les résultats contenant uniquement les données de corrélation ». Cela enregistrera même les données lorsque l’échantillon est assez agrégé (c’est-à-dire au-delà de la température d’agrégation) et peut être utile à conserver.

Le SOP estime la durée de l’expérience et cela est affiché dans les sections tendance et Mesure de taille (il peut être nécessaire de cliquer sur quelque chose d’autre pour mettre à jour le calcul). Le SOP ou la mesure manuelle peuvent ensuite être démarrés comme une mesure régulière.

Aujourd’hui

• Agrégation d’insuline, utiliser de l’arginine pour la stabilisation ?
• Nouveaux utilisateurs de Nanosizer – guide rapide vers la perfection
• Qu’est-ce que la déviation du potentiel Zêta ?

Si vous avez des questions, veuillez m’envoyer un e-mail à ulf.nobbmann@malvern.com. Merci ! Bien que les opinions exprimées soient généralement celles de l’auteur, certaines parties peuvent avoir été modifiées par notre équipe éditoriale.