Configuration de l’ensemble de colonnes GPC/SEC le mieux adapté à votre échantillon

Si vous avez déjà travaillé avec GPC/SEC (par exemple, OMNISEC), vous savez que toutes les analyses dépendent de la configuration de l’ensemble de colonnes. Et il peut parfois être difficile de choisir les colonnes adaptées à votre application. Parfois, une nouvelle configuration d’ensemble de colonnes entièrement distincte peut être nécessaire pour différents types d’échantillons.

Il y a plusieurs facteurs à considérer lors du choix de l’ensemble de colonnes le mieux adapté à votre échantillon. Vous devez tenir compte de la gamme de tailles/poids moléculaires, de la compatibilité entre la phase mobile à utiliser pour dissoudre l’échantillon et la colonne, ainsi que de la compatibilité entre les groupes fonctionnels de l’échantillon et la phase stationnaire de la colonne. Si plusieurs colonnes sont utilisées, vous devez vérifier si elles se complètent mutuellement et dans quel ordre elles doivent être connectées.

Dans cet article, nous fournirons des informations générales sur les colonnes et des idées sur comment créer un ensemble de colonnes adapté à votre échantillon. Les informations présentées ici concernent principalement le choix de l’ensemble de colonnes optimal du point de vue de la gamme de tailles/poids moléculaire. Pour des informations sur les colonnes disponibles pour les analyses avec diverses phases mobiles, consultez l’article lié ici et le webinaire.

Que se passe-t-il dans un ensemble de colonnes?

Commençons par un bref aperçu du fonctionnement de la séparation au sein d’un ensemble de colonnes GPC/SEC. Comme illustré dans l’image ci-dessus, un mélange dissout de deux échantillons de tailles différentes est introduit dans la colonne. Au fil du temps, deux fractions d’échantillon et le solvant de dissolution traversent la colonne à des vitesses différentes. Le plus grand échantillon est élué en premier (Population 2), suivi par l’échantillon de plus petite taille (Population 1), et enfin, le solvant de dissolution est élué en dernier.

Il est important de comprendre que la séparation se fait en fonction de la taille moléculaire de l’échantillon et non de sa masse moléculaire!

Cette séparation se produit parce que la phase stationnaire de la colonne est constituée de particules de gel à pores. Ces pores sont suffisamment grands pour permettre la diffusion des molécules d’échantillon lorsqu’elles traversent la colonne. Les petites molécules diffusent plus facilement dans les pores et y passent donc plus de temps que les molécules de taille moyenne et grande. Les plus grosses molécules ne diffusent pas facilement dans les pores, ce qui leur permet de traverser la colonne plus rapidement et plus directement.

En GPC/SEC, la séparation est basée sur la taille moléculaire, les grosses molécules étant éluées en premier, suivies par les molécules de taille moyenne et enfin les petites molécules. Veuillez consulter l’animation ci-dessous pour une représentation de ce processus. Le grand triangle est élué en premier car il ne passe pas beaucoup de temps à diffuser dans les pores, suivi par le carré moyen, et enfin, le petit cercle qui peut facilement se déplacer à travers les pores.

Colonnes à lit mixte et colonnes à taille de pores unique

La différence entre ces deux types de colonnes est détaillée dans cet article. En résumé, les colonnes à lit mixte contiennent une phase stationnaire en gel avec un mélange de tailles de particules et de pores, offrant une résolution sur une large gamme de tailles/poids moléculaires. Les colonnes à taille de pores unique contiennent un gel stationnaire homogène qui offre une résolution exceptionnelle sur une gamme relativement limitée de tailles/poids moléculaires.

Comment combiner des colonnes pour créer un ensemble de colonnes

Pour générer un ensemble de colonnes optimisé pour votre échantillon, vous devrez probablement combiner deux colonnes ou plus. (Cependant, si une seule colonne fournit une résolution suffisante pour votre échantillon et est tout ce dont vous avez besoin, il n’est pas nécessaire de combiner des colonnes.) Cela permet d’économiser du temps et de la phase mobile. C’est souvent le cas pour les échantillons de protéines. Bien que la masse moléculaire des protéines couvre une large gamme, la gamme de tailles des échantillons de protéines est plus étroite que celle des polymères en raison de leur structure repliée.

Il y a trois approches générales que nous vous proposons lorsque vous combinez des colonnes pour créer un ensemble. Veuillez noter qu’il s’agit de suggestions et qu’il ne s’agit pas d’une liste exhaustive.

Deux colonnes à lit mixte: C’est l’ensemble de colonnes universel le plus courant, incluant les colonnes organiques, aqueuses et spéciales. Pour être clair, nous utilisons deux colonnes à lit mixte identiques. Par exemple, lorsque nous analysons un lot de polysaccharides, nous utilisons souvent deux colonnes A6000M à lit mixte pour les analyses aqueuses. L’utilisation de deux colonnes à lit mixte comme celles-ci tend à maximiser la gamme de tailles/poids moléculaires et à atteindre un point de performance optimal en maintenant le temps d’exécution en dessous de 45 minutes environ.

Combinaison de colonnes à haute/basse masse moléculaire et colonnes à lit mixte: Pour les échantillons qui contiennent des espèces de taille/poids moléculaire particulièrement élevée ou faible, comme les agrégats ou les oligomères, nous préfèrons ajouter une colonne à taille de pores unique haute/basse avec une colonne à lit mixte. Les colonnes à taille de pores unique haute/basse masse moléculaire garantissent une résolution suffisante sur des caractéristiques spécifiques du spectre de tailles de l’échantillon à une extrémité du continuum, tandis que la colonne à lit mixte couvre le reste de la matière échantillon. Si vous souhaitez améliorer la résolution entre le pic d’échantillon et le pic de solvant, ajoutez simplement une colonne à basse masse moléculaire à votre colonne à lit mixte.

Combinaison de plusieurs colonnes à taille de pores unique: Cette stratégie est appropriée lorsque vous savez que vous n’avez pas besoin de la résolution de gamme complète de tailles/poids moléculaires qu’offre une colonne à lit mixte. Des ensembles de colonnes de ce type peuvent être utiles dans des environnements de contrôle qualité où des échantillons similaires sont surveillés. L’avantage est que vous pouvez atteindre une résolution maximale à la taille/poids moléculaire de l’échantillon pertinent. Vous pouvez également combiner plus de deux colonnes à taille de pores unique pour couvrir une large gamme de tailles/poids moléculaires, comme T5000 + T3000 + T1000. Dans cet exemple, le temps d’analyse est prolongé, mais une résolution améliorée est obtenue.

Lorsque vous combinez des colonnes à taille de pores unique, il est important de s’assurer que les colonnes ne sont pas séparées par une autre colonne. Ceci empêche une différence dans l’intervalle de résolution. Pour revisiter l’exemple de trois colonnes à taille de pores unique, nous déconseillons simplement de combiner T5000 + T1000. Cette pratique peut générer des profils d’élution comme ceux illustrés ci-dessous, avec des formes de pics étranges et des artefacts résultants dans les données qui sont dus à la chromatographie et non à votre échantillon.

L’ordre des colonnes

Beaucoup se demandent dans quel ordre connecter les colonnes lorsqu’elles sont combinées.

L’ordre raisonnable que nous recommandons est de commencer par la colonne de la plus grande taille/poids moléculaire et ensuite de descendre à la colonne de la plus petite taille/poids moléculaire. Cela permet au mélange d’échantillons complet d’être introduit dans le premier ensemble de colonnes afin que les plus grosses molécules puissent commencer à être séparées. Si les colonnes sont arrangées dans l’ordre inverse, les plus grosses molécules devront être pressées à travers les colonnes à faible taille/poids moléculaire, ce qui pourrait potentiellement entraver la diffusion des plus petites molécules dans les pores.

C’est pourquoi, dans les exemples ci-dessus, nous avons utilisé les colonnes T5000 + T3000 + T1000. Lors de la combinaison de colonnes à taille de pores unique avec une colonne à lit mixte, ajoutez une colonne à taille de pores unique pour haute taille/poids moléculaire avant la colonne à lit mixte et une colonne à taille de pores unique pour basse taille/poids moléculaire après la colonne à lit mixte.