Meilleures Pratiques pour la Calorimétrie Différentielle à Balayage des Protéines et Biopolymères

par Verna Frasca, Tuesday, 14th August 2018

Dans un blog précédent, j’ai discuté des meilleures pratiques pour obtenir des données de haute qualité avec un MicroCal DSC. Voici d’autres meilleures pratiques pour le système MicroCal PEAQ-DSC, ainsi que pour les systèmes MicroCal VP-Capillary DSC et VP-DSC. Ces meilleures pratiques s’appliquent à l’analyse des protéines en solution, et d’autres biopolymères.

Exigences relatives aux échantillons :

Pour obtenir des données de Calorimétrie Différentielle à Balayage (DSC) de haute qualité, les échantillons doivent être dans le tampon souhaité (pH, sel, excipients, etc.), et le tampon correspondant est utilisé dans la cellule de référence DSC et pour les scans tampon-tampon.
Préparer les échantillons dans le tampon souhaité par dialyse, une colonne de dessalage, ou une autre méthode d’échange de tampon.
Conserver le tampon de la dialyse/échange de tampon pour l’utiliser avec la cellule de référence, les scans tampon-tampon, et la dilution des échantillons.
Plage de concentration protéique recommandée de 0,1 mg/ml à 2 mg/ml.
Les T_m obtenus par DSC peuvent dépendre de la concentration.
- Pour les études de dépistage et de comparabilité/similarité du T_m, s’assurer que toutes les protéines sont équipées de la même concentration.

Réglages DSC :

Lors de l’utilisation de la DSC pour le dépistage du T_m et les études de comparabilité/similarité, s’assurer que tous les réglages sont les mêmes, y compris le taux de balayage, la plage de température, le mode de rétroaction, le thermostat avant balayage.
- Les T_m et les thermogrammes DSC peuvent dépendre du taux de balayage et du mode de rétroaction.
Plage de température : commencer le balayage 10-20°C en dessous du 1^er T_m, et terminer le balayage 10-20°C au-dessus du T_m final.
Taux de balayage :
- Le taux de balayage typique pour les protéines et les acides nucléiques est de 60 à 90 °C/h
- Le taux de balayage typique pour les lipides est de 30 à 60°C/h
- Pour MicroCal PEAQ-DSC et VP-Capillary DSC, utiliser un taux de balayage de 180 à 240 °C/h pour augmenter le débit d’échantillon lors du dépistage du T_m
“Modes de rétroaction” recommandés :
- protéines – aucun ou faible
- ADN et ARN – faible ou moyen
- Lipides – élevé
“Thermostat avant balayage” recommandé de 3 à 15 minutes.

Pour les systèmes automatisés MicroCal PEAQ-DSC et VP-Capillary DSC :

S’assurer que les échantillons sont stockés à la température appropriée avant l’analyse DSC. Pour les protéines et autres biomolécules, régler la température de la pile de refroidissement à 5 à 10°C. Si vous étudiez un matériau thermostable, vous pouvez régler la pile de refroidissement à 25°C.
Utiliser un minimum de trois remplissages de purge (appelé “nombre de coups de remplissage” sur le VP-Capillary DSC) pour remplir les cellules DSC à partir de la plaque de 96 puits.
Programmer le nettoyage des cellules en utilisant 20% de Contrad 70 ou 14% de Décon 90.

Qualité des données brutes DSC :

Avoir toujours un scan tampon-tampon apparié (effectué dans des conditions de balayage identiques) pour l’analyse des données. Si désiré, vous pouvez effectuer un scan tampon-tampon avant chaque échantillon.
Des scans tampon-tampon fréquents s’avèrent un contrôle supplémentaire des performances de l’instrument pour s’assurer que les cellules DSC sont propres et que l’instrument fonctionne correctement.
Les scans tampon-tampon doivent être reproductibles tout au long de la séquence (en supposant les mêmes paramètres de course DSC).
Avec le PEAQ-DSC automatisé, et sa pompe de lavage efficace et ses protocoles de nettoyage des cellules DSC optimisés, il est possible d’effectuer trois (ou plus) échantillons d’affilée, sans effectuer de scans tampon-tampon entre eux.
La valeur DP (en mcal/min) pour le thermogramme DSC brut doit être proche de zéro au début des scans tampon-tampon ou eau-eau.
Au début des scans de protéines, la valeur DP devient généralement plus négative, comparée aux scans tampon-tampon appariés. Des concentrations protéiques plus élevées affichent une déviation négative plus importante. Avec un bon appariement des tampons, cette différence de DP devrait être d’environ 0,15 à 0,25 mcal/min pour chaque 1 g/L de protéine (Figure 1).
Si la différence de DP entre les scans protéines et tampon-tampon est supérieure à 1 mcal/min, cela peut être dû à une incompatibilité de tampon entre la protéine et le tampon, une cellule sale, une cellule sous-remplie, des bulles dans la cellule, ou une concentration protéique plus élevée (Figure 2).