Points clés pour la mesure DSC (Calorimétrie différentielle à balayage) des protéines et des biopolymères

MicroCal PEAQ-DSC (Calorimètre à balayage différentiel) pour l’évaluation de la stabilité biomoléculaire, voici les points clés pour la mesure DSC des protéines et des biopolymères.

Pour obtenir des données DSC de haute qualité, à quoi faut-il faire attention ? Quels sont l’état de l’échantillon et les conditions de mesure ? Vérifions cela avec la liste suivante !

【Conditions de l’échantillon】

Pour obtenir des données DSC de haute qualité, suivez les éléments ci-dessous.

• Assurez-vous que la composition des tampons est la même pour la cellule échantillon et la cellule de référence.
• Ajustez l’échantillon avec une dialyse, une colonne de désalinisation ou une autre méthode de substitution de tampon pour obtenir le tampon désiré.
• Gardez le liquide de dialyse et le tampon utilisé pendant la substitution pour la cellule de référence et les scans tampon-tampon (ci-après, scan de tampon).
• La concentration recommandée pour les échantillons de protéines est de 0,1 à 2 mg/mL.
• Les valeurs T_m (température de transition moyenne) obtenues par DSC sont dépendantes de la concentration.
  Aussi, pour le criblage des T_m et l’évaluation d’équivalence, veillez à ce que toutes les concentrations d’échantillons soient égales.

【Configuration des conditions de mesure】

• Pour réaliser un criblage des T_m ou une évaluation d’équivalence par DSC, il est nécessaire d’harmoniser toutes les conditions de mesure (taux de scan, plage de température, mode de retroaction, thermostat pré-scan, etc.). La forme du thermogramme est influencée par le taux de scan et le mode de rétroaction.
• Plage de température : Fixez la température de début de mesure 10 à 20 °C en dessous de la première valeur de T_m et fixez la température de fin de mesure 10 à 20 °C au-dessus de la dernière valeur de T_m.
• Taux de Scan (valeurs recommandées généralement)
  • Protéines, acides nucléiques : 60-90 °C/h
  • Lipides : 30-90 °C/h
  Si vous souhaitez augmenter le débit pour un criblage des T_m, mesurez à un taux de 180-240 °C/h (modèles compatibles : PEAQ-DSC, VP-Capillary DSC).
• Mode de rétroaction
  • Protéines : none ou low
  • Acides nucléiques : low ou medium
  • Lipides : high
• Thermostat pré-scan : 3-15 minutes recommandées.

【Points d’attention pour les systèmes avec échantillonneur automatique】

• Pour la stabilité des échantillons, stockez-les à une température adéquate. Si l’échantillon est une protéine ou un autre biopolymère, réglez la température du refroidisseur à 5-10 °C. Si l’échantillon est stable, 25 °C est acceptable.
• Purge/Remplissage (ou nombre de cycles de remplissage) : Réglez sur au moins trois fois.
• Incorporez le nettoyage avec un détergent à 14% Decon90 (ou 20% Contrad70) dans le protocole.

【Qualité des données brutes de mesure】

• Les scans d’échantillons et de tampons doivent être réalisés sous les mêmes conditions de scan. Si nécessaire, effectuez un scan de tampon avant chaque échantillon.
• Des scans de tampon fréquents peuvent évaluer que la cellule est propre et que l’équipement fonctionne bien.
• Lorsque le programme de mesure est toujours réglé sur les mêmes conditions de scan, la reproductibilité des scans de tampon doit être élevée.
  (Avec le PEAQ-DSC Automated, il est possible d’intercaler trois échantillons consécutifs (ou plus) sans réaliser de scan tampon entre chaque grâce à une pompe de nettoyage hautement efficace et un protocole de nettoyage optimisé.)
• Les valeurs DP (mcal/min) proches de zéro doivent être obtenues au début des mesures des scans de tampon ainsi que des scans eau-eau.
• Lors des mesures des échantillons de protéines, la valeur DP est négative par rapport au scan de tampon. Avec une concentration de protéines élevée, la valeur négative sera plus importante. Si l’écart de composition du tampon est faible, pour une concentration de protéines de 1 g/L, la divergence entre le scan d’échantillon et le scan de tampon devrait être d’environ 0,15 à 0,25 mcal/min. (Figure 1)

Lorsque la divergence des valeurs DP entre le scan d’échantillon et le scan de tampon est supérieure à 1 mcal/min, les raisons possibles pourraient inclure : (Figure 2)

• Désaccord entre l’échantillon et le tampon
• Cellule sale
• Remplissage insuffisant
• Présence de bulles
• Échantillon de concentration très élevée