DSC et stabilité des protéines : Que signifie le changement d’enthalpie ?

La Microcalorimétrie Différentielle de Balayage (DSC) est la seule méthode analytique qui mesure directement le changement d’enthalpie (∆H) d’une transition thermique, comme la dénaturation thermique d’une protéine, d’un acide nucléique ou d’un autre biopolymère.

Qu’est-ce que ∆H ?

∆H est l’énergie totale absorbée pour élever le système à la température T à pression constante. Pour une protéine, cela signifie l’énergie (chaleur) dépensée pour la déplier, et le ∆H est positif, représentant un processus endothermique. Cette énergie est associée à tous les mouvements atomiques et moléculaires ainsi qu’à l’énergie des liaisons maintenant la protéine dans sa conformation repliée. 

∆H est calculé en intégrant l’aire sous le thermogramme (voir figure ci-dessous), et est représenté en calories (ou joules) par mole de protéine. Lorsque la protéine est exposée à des températures croissantes lors d’une expérience DSC, la protéine commence à se dénaturer thermiquement, les liaisons non covalentes étant rompues. Le ∆H est lié au nombre de liaisons nécessaires pour maintenir la protéine dans sa conformation native (repliée).

∆H dépend de la précision avec laquelle nous mesurons la concentration totale en protéines. Si la concentration en protéines n’est pas déterminée avec précision, la valeur de ∆H calculée sera impactée.

Que nous indique la valeur de ∆H en pratique ?

Lorsque vous comparez les résultats DSC de différentes protéines, la protéine avec la plus grande valeur de ∆H n’est pas nécessairement plus stable qu’une protéine avec un petit ∆H. Comme ∆H est normalisé par la concentration molaire totale en protéines, la valeur sera souvent proportionnelle à la taille de la protéine. La plupart des protéines ont la même densité de liaisons (liaisons par volume). Il est raisonnable de s’attendre à ce qu’une protéine avec un poids moléculaire plus grand ait également un ∆H plus grand.

∆H dépend du pourcentage de protéine native en solution

Un point important à prendre en compte est que le DSC ne mesure la valeur de ∆H que pour la protéine qui est initialement dans sa conformation repliée (native). L’ampleur de ∆H dépend de la concentration de la fraction repliée. Si la fraction initiale de protéine repliée est inférieure à 100 % de la concentration totale en protéines, la valeur de ∆H calculée sera d’autant plus petite.

La figure ci-dessous montre des thermogrammes DSC pour la même protéine, mesurés à différents moments durant le stockage. Le thermogramme bleu est pour une protéine fraîchement préparée qui est 100 % native (repliée). À mesure que l’échantillon de protéine se dégrade au cours du stockage, la fraction de protéine native dans la solution commence à diminuer, entraînant une diminution de l’enthalpie dans les thermogrammes DSC. Nous pouvons utiliser les valeurs relatives de ∆H des différents thermogrammes pour estimer la fraction de protéine repliée pour chaque échantillon, lorsque nous avons un thermogramme DSC de référence avec 100 % de protéine native.

Dans cet exemple, le ∆H pour l’échantillon avec le thermogramme vert a 50 % du ∆H de l’échantillon bleu, donc c’est 50 % de protéine repliée. L’échantillon orange a 25 % de protéine repliée, et l’échantillon rouge a 10 % de protéine repliée, par rapport au thermogramme bleu.

Enthalpies calorimétriques et de van’t Hoff

Jusqu’à présent dans ce blog, nous avons parlé de l’enthalpie « calorimétrique » qui est mesurée directement par le DSC, souvent représentée par ∆H_cal. Il existe un autre type d’enthalpie que nous pouvons calculer à partir des données DSC, l’enthalpie de van’t Hoff – ∆H_vH.  Cette valeur est disponible à partir de l’ajustement au modèle Non-Two-State du DSC. ∆H_vH est également l’enthalpie déterminée par toute technique de fusion thermique non calorimétrique (indirecte), comme le dichroïsme circulaire.

Avec le DSC, ∆H_cal est déterminé uniquement par l’aire sous un pic de transition, tandis que ∆H_vH est déterminé uniquement par la forme du pic de transition. Plus la transition est nette, plus ∆H_vH est grand, et vice versa. ∆H_cal dépend de la concentration, mais H_vH ne l’est pas. 

Généralement, un rapport ∆H_cal/∆H_vH égal à 1 est pris comme indication que la transition à l’étude se conforme au mécanisme de dépliement à deux états. Un rapport ∆H_cal/∆H_vH supérieur à un indique la présence d’intermédiaires significativement peuplés ; et un rapport ∆H_cal/∆H_vH inférieur à un indique des interactions intermoléculaires.

En utilisant le rapport ∆H_cal/∆H_vH, nous pouvons estimer qu’une grande fraction de la protéine est inactive. Si nous avons une protéine à domaine unique simple, et que nous supposons qu’il n’y a pas d’intermédiaires, on peut s’attendre à ce que son dépliement ait un rapport de ∆H_cal/∆H_vH non trop éloigné de 1. Ainsi, un  ∆H_cal significativement inférieur au ∆H_vH, peut indiquer qu’une grande fraction de la protéine est déjà inactive. 

Pour résumer, l’analyse DSC des données de ∆H peut fournir des informations sur le mécanisme de dépliement des protéines, et combien de protéines sont dans leur conformation native.

Lectures complémentaires

• Microcalorimétrie Différentielle de Balayage (DSC): Théorie et pratique
• Microcalorimétrie Différentielle de Balayage (DSC) pour le Développement Biopharmaceutique : Polyvalence et Puissance
• La Puissance de la Chaleur : Approfondir avec la Microcalorimétrie Différentielle de Balayage pour Étudier les Caractéristiques Clés des Protéines