Extrait de livre : Évaluation calorimétrique des interactions moléculaires par calorimétrie de titration isotherme (ITC)

Médecine Expérimentale supplément « Analyse parfaite des interactions pour la recherche de médicaments » (Éditeur spécialisé en sciences de la vie et médecine Yodosha) Chapitre 1 : Standards d’analyse d’interaction dans la recherche de médicaments – I Recherche de médicaments de petites et moyennes molécules – 5 (Nagatoishi Akira, Tsumoto Kohei) présente un article sur l’ITC. Cet article est publié avec l’autorisation de Yodosha.

Évaluation calorimétrique des interactions moléculaires par calorimétrie de titration isotherme (ITC)

Nagatoishi Akira, Tsumoto Kohei

Objectif et points essentiels de l’expérience

La calorimétrie de titration isotherme (ITC) est un dispositif permettant de détecter les changements de chaleur lors des interactions moléculaires. En mesurant les changements de chaleur des interactions non covalentes, il est possible de connaître directement la qualité thermodynamique de la liaison et d’obtenir ainsi des informations sur le mode de liaison et la spécificité des composés sélectionnés par criblage. Dans l’optimisation structurelle, l’analyse par des paramètres thermodynamiques permet de vérifier si l’interaction suit la stratégie de conception. En combinant cela avec des informations structurelles, il est possible d’affiner les directives de conception et de les connecter aux stratégies de conception suivantes.

Introduction

Dans le développement de médicaments de petites molécules, la liaison des petites molécules aux protéines est cruciale en raison de leur mode d’interaction spécifique. Il est donc important d’obtenir des connaissances spécifiques à chaque étape, de la recherche à la validation et l’optimisation. Les formations de liaisons non covalentes entre molécules, les changements de structure conformationnelle des protéines et les changements d’état de solvatation en solution aqueuse sont autant de facteurs de réactions exo- et endothermiques. Par conséquent, la mesure thermique joue un rôle clé dans l’analyse des interactions avec les molécules ciblées. La calorimétrie de titration isotherme (ITC) est la seule méthode d’analyse permettant d’observer les changements thermiques à l’interaction désirée, et elle permet une analyse thermodynamique précise. Pour une utilisation ITC de base, se référer au Chapitre 1-13.

Optimisation : Grâce à la validation, la spécificité envers la protéine cible est promise, et le composé est confirmé comme un ‘hit’. Depuis ce composé ‘hit’, l’extension du squelette et l’ajout/amélioration de groupes fonctionnels améliorent l’affinité de liaison et l’activité fonctionnelle. Ces développements structuraux sont appelés optimisation.

Dans l’optimisation des médicaments de petites molécules, un exemple rétrospectif important sur l’utilité des connaissances thermodynamiques est décrit. Les paramètres thermodynamiques pour les protéines cibles des inhibiteurs de la protéase du VIH, médicaments pour traiter le SIDA, sont résumés dans la Figure 1A^1,2). Cette figure organise, par ordre d’approbation, les inhibiteurs développés sur une décennie depuis l’approbation initiale d’IDV (1996). Chaque nouvel inhibiteur montre une tendance à avoir une plus grande affinité de liaison (ΔG plus négatif) avec la protéine cible. Ce qui est remarquable, c’est le profil thermodynamique (Figure 1B).

Les médicaments initiaux (comme IDV) étaient à entraînement entropique avec un enthalpie de liaison défavorable (ΔH) et une entropie (ΔS) favorable. Cependant, au fur et à mesure que les médicaments sont optimisés, l’équilibre des paramètres thermodynamiques se déplace du contrôle entropique au contrôle enthalpique (Figure 1B). Alors que les inhibiteurs précoces étaient fortement influencés par l’entropie, les nouveaux inhibiteurs approuvés montrent une contribution plus importante de l’enthalpie. On peut aussi observer une corrélation de compensation ΔH−ΔS pour ces inhibiteurs. Cette tendance se retrouve également pour des traitements de l’hypercholestérolémie comme les statines ou pour les bisphosphonates utilisés contre l’ostéoporose^3,4). Ces résultats suggèrent que la haute spécificité envers les protéines cibles, impliquant à la fois des contributions enthalpiques et entropiques, est un facteur clé dans l’optimisation des médicaments. Dans l’optimisation et l’amélioration structurelles pour accroître l’efficacité des médicaments, il est extrêmement utile de comprendre les contributions thermodynamiques des groupes fonctionnels, un aspect clé pour apprécier la qualité des médicaments ciblant des molécules. Déduire quelle partie de la molécule contribue à l’enthalpie et quelle partie à l’entropie n’est pas facile, mais vérifier les paramètres thermodynamiques et concevoir rationnellement les médicaments, peuvent fournir des informations cruciales pour la spécificité de conception des petites molécules vis-à-vis des protéines cibles.

Préparation

Pour les méthodes de préparation de base, se référer au Chapitre 1-13. Lors de l’utilisation de composés, étant donné qu’ils contiennent souvent du DMSO, il faut prêter une attention particulière à la préparation afin d’éviter les variations de concentration.

Protocole

Les opérations de base et les procédures expérimentales se réfèrent au Chapitre 1-13. En général, il est recommandé de placer la protéine sur le côté cellule et le composé sur le côté seringue.

Réagir aux problèmes

Attention aux changements de chaleur dus au DMSO
Lorsqu’on utilise des composés, il est fréquent que le système d’essai contienne du DMSO, ce qui peut entraîner des chaleurs de réaction inattendues ou des chaleurs de dilution. Comme pour SPR, le DMSO affecte la chaleur des réactions d’interaction dans l’ITC. La préparation des échantillons côté cellule et côté seringue doit être effectuée séparément, avec une grande attention pour s’assurer qu’il n’y a pas de déviation de concentration de DMSO. Des erreurs légères dans la concentration de DMSO peuvent se manifester en tant que chaleur de dilution, masquant les interactions thermiques recherchées. Une mesure de la chaleur de dilution des composés seuls doit toujours être effectuée et l’échantillon doit être préparé pour minimiser autant que possible les changements de chaleur dus au DMSO.

Exemple d’expérience 1 : Détection par méthode compétitive utilisant des mesures ITC⁵⁾

Trouver des petites molécules qui se lient spécifiquement aux protéines cibles pour la découverte de médicaments implique de rechercher de manière exhaustive l’espace chimique à la surface des protéines, ce qui représente une stratégie de criblage efficace et efficiente. La stratégie de découverte de médicaments via des fragments libres de plus petit poids moléculaire par rapport à la moyenne des bibliothèques de composés est d’autant plus d’actualité. Cependant, les composés fragmentés ayant des structures chimiques relativement simples présentent souvent une faible affinité, avec des constantes de dissociation dans l’ordre des mM. Ainsi, l’ITC, qui permet une approche analytique physico-chimique à haute sensibilité, est considérée comme une méthode évaluative viable. Comme dans l’exemple des inhibiteurs de la protéase VIH mentionné précédemment, une liaison spécifique se traduit souvent par une réaction exothermique significative et une convergence de la réaction. Ce genre de profil indique souvent la formation de liaisons hydrogène. À l’inverse, une interaction non spécifique ne présente pas de convergence thermique de la réaction, tandis que les interactions hydrophobes se traduisent par une réaction endothermique. Pour ces raisons, les composés de la librairie présentant des réactions exothermiques constituent de bons candidats. Lorsqu’un site de liaison à la protéine cible est bien identifié, et qu’on connaît des substrats ou ligands qui se lient à ce site, une méthode d’essai compétitive est une stratégie efficace. En utilisant l’ITC pour effectuer un test compétitif, on parvient à sélectionner en faveur des composés réactionnels exothermiques spécifiques au site de liaison (Figure 2). Suit une explication d’exemples concrets menés par les auteurs de cet article.

1. Protéine cible

L’enzymes cibles de cette étude étaient la cétostéroïde isomérase (KSI) et la 3-oxo-Δ5-cétostéroïde isomérase (qui catalyse l’isomérisation des 3-oxo-Δ5-cétostéroïdes en isomères conjugués ayant une activité hormonale).

2. Recherche de molécules de faible poids

Pour KSI, la sélection de composés a été effectuée par criblage SPR à partir de librairies de fragments.

3. Assay ITC competitif (SITE)

Pour les composés candidats retenus lors du criblage, une évaluation de la validation des hits a été effectuée efficacement via un essai compétitif utilisant ITC. Cette technique d’analyse consiste à équilibrer le composé selecté et la protéine cible dans un système de solution en ajoutant un ligand connu (Figure 2A). Si le fragment interagit sur le site de liaison de KSI, le ligand connu d’affinité plus élevée (comme l’acide désoxycholique : DOC) agit comme un composé de contrôle positif, extractant le fragment pour se stabiliser sur le site de liaison. Lorsque le fragment a induit une interaction exothermique, la dissociation lors de la liaison au DOC est observée comme une réaction endothermique.

Pour augmenter le débit, l’essai compétitif de changement thermique a été conçu pour être évalué en une seule injection, ce qu’on appelle la méthode SITE (single-injection thermal extinction). Utilisant cette méthodologie SITE, la validation des hits pour les fragments liant KSI a été réalisée. Les résultats ont montré que le DOC a concurrencé les composés sur le site de liaison de KSI avec une exothermie significative, permettant la sélection de composés de type ‘hit’ à entraînement enthalpique (Figure 2B). D’autre part, l’ERK2 kinase, impliquée dans la cascade MAPK de transmission du signal cellulaire, a également été exploitée pour isoler des composés issus du criblage via la bibliothèque de fragments.

Ce modèle illustre bien l’efficacité de l’ITC pour identifier des composés de découverte, contrôlant bien plus qu’une simple optimisation, par leur chaleur d’interaction. En général, les réactions exothermiques stimulées par des liaisons non covalentes comme les liaisons hydrogène ont une réputation d’altérer la spécificité d’interaction, et concevoir des liaisons hydrogène de façon rationnelle est souvent un défi. Dans un contexte de découverte initiale, la recherche active de petits composés formant des liaisons hydrogène peut alimenter un meilleur développement de composés leaders.

Exemple d’expérimentation 2 : Analyse ITC pour l’optimisation de petites molécules⁶⁾

1. Protéine cible

Ici, la protéine cible d’intérêt est DJ-1, impliquée de manière critique dans des maladies comme le Parkinson et le cancer (Figure 3A). Bien que DJ-1 soit connue comme enzyme avec des activités glyoxales, leur lien avec des maladies n’est pas entièrement élucidé et une meilleure compréhension peut potentiellement mener à de nouvelles approches thérapeutiques. Notre travail s’est concentré sur la libération des effets inhibiteurs des mécanismes enzymatiques de DJ-1 comme porte d’entrée pour de nouvelles thérapeutiques.

2. Recherche de petites molécules

Via le criblage SPR, quelques molécules potentielles ont été choisies comme suites pour cette étude. L’une, constituée d’un squelette isatine, a émergé comme une piste prometteuse (Figure 3B).

3. Validation des hits (ITC)

L’évaluation ITC sur ces composés a révélé qu’Isatin interagissait avec DJ-1 par un mécanisme d’entrainement enthalpique avec une énergie (ΔH = -11.6 kcal/mol, –TΔS = 4.1 kcal/mol, K_D = 3.2 μM), apportant un aperçu important sur le style d’interaction (Figure 3C). Utilisant ΔG = ΔH – TΔS, le K_D peut être déterminé par la relation inverse de K_A. De plus, une analyse de stabilité thermique (DSF) par fluorescence montre qu’Isatin accroît également la stabilité thermique de DJ-1.

4. Analyse structurelle

L’analyse structurelle d’un complexe cocrystalisé d’isatin et DJ-1 a confirmé de nombreux sites d’interaction via des liaisons covalentes et non-covalentes, révélant une formation unique de complexe (Figure 4A, B). S’appuyant sur cette structure, une analyse mutante a suggéré qu’Isatin interagissait homogène dans la solution comme avec le site de liaison prévu du cristal (Figure 4C).

5. Optimisation des composés

Grâce aux informations structurales obtenues, une amélioration de l’affinité des composés était visée. Il a été possible de parvenir à une affinité de l’ordre du nM pour le composé #15 (Figure 5). Le composé #15 a contribué entropiquement (ΔH = -11.5 kcal/mol, –TΔS = 2.0 kcal/mol, K_D = 0.1 μM) et a également augmenté la stabilité envers DJ-1. Les analyses intracellulaires avec Isatin ont confirmé l’activité inhibitrice de ces composés dans les voies de responsables enzymatiques intracellulaires. Les deux, Isatin et composé #15, ont montré par le moyen de l’essai de décalage thermique cellulaire (CETSA) qu’ils stabilisent DJ-1 dans une matrice cellulaire. Ces résultats illustrent comment l’ITC permet d’isoler des composés à spécificité enthalpique initiale et, grâce à l’optimisation structurelle, contribue à l’ajustement entropique, indiquant également l’efficacité de l’approche ITC pour sélectionner des composés ciblant des protéines à l’intérieur des cellules.

Conclusion

Ce chapitre a présenté des exemples de recherche liés au développement de médicaments à petites molécules en utilisant des mesures thermiques. Pour l’identification des inhibiteurs à petites molécules, il est courant de se concentrer sur des activités biologiques élevées, inhibitorias et de hautes activités de liaison en tant que critères de sélection. Cependant, il est encore fréquent de progresser sans complètement comprendre le mécanisme d’interaction, ce qui empêche un design optimal de lead structurel et soulève des corrélations structure-activité structurelle. En outre, des molécules cibles apparaissent, qui ne se limitent plus aux enzymes et récepteurs classiques, mais s’élargissent à des protéines membranaires ou des protéines intrinsèquement désordonnées, qui représentent souvent des cibles biochimiquement difficiles. Ces défis rendent leur manipulation plus complexe avec des approches/assays traditionnels souvent inadéquats. Même en absence d’un site de liaison clair notamment pour les inhibiteurs à petites molécules ciblant les poches de substrats enzymatiques, agissant sur des interfaces de interactions protéine-protéine (PPI) ou de grands complexes protéiques. Des technologies detectant avec plus de sensibilité et d’évaluant quantitativement les comportements de liaison sont essentielles pour sélectionner des composés se liant spécifiquement. Dans la découverte moléculaire, là où les défis sont nombreux, le critère clé reste l’affinité élevée et la spécificité envers les cibles. Les techniques de recherche et analyse de haute précision, telle que l’utilité de l’ITC, démontrée dans ce texte, sont donc cruciales. Ce document n’a pas abordé les investissements de l’équipe dans des composés à faible masse moléculaire inhibiteurs cibles pour les enzymes métaboliques de la sérine (SHMT), prisées pour la lutte contre la malaria ou comme cibles oncogéniques, identifiant deux composés hits, l’un à commande enthalpique et l’autre entropique grâce au screening par ITC⁷. Les profils thermaux mesurés par ITC ont le potentiel d’être une technique précieuse dans l’optimisation structurelle et dans le design moléculaire rationnel des hits avec spécificité.

◆ Références
1) Ohtaka H & Freire E.: Prog Biophys Mol Biol, 88:193–208, 2005
2) Muzammil S, et al.: J Virol, 81:5144–5154, 2007
3) Carbonell T & Freire E.: Biochemistry, 44:11741–11748, 2005
4) Kawasaki Y, et al.: Chem Pharm Bull (Tokyo), 62:77–83, 2014
5) Kobe A, et al.: J Med Chem, 56:2155–2159, 2013
6) Tashiro S, et al.: ACS Chem Biol, 13:2783–2793, 2018
7) Nonaka H, et al.: Nat Commun, 10:876, 2019

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