Pourquoi LALS est-il meilleur quand il est proche ? – Système GPC Viscotek

 

Introduction 


  Actuellement, lors d’expériences de GPC/SEC (Chromatographie par perméation de gel/exclusion de taille), les détecteurs de diffusion de lumière laser sont couramment utilisés pour mesurer la masse moléculaire.  

  En raison de l’avantage que la masse moléculaire peut être mesurée directement à partir du signal du détecteur LS (diffusion de lumière), il n’est pas nécessaire de corriger le volume d’élution avec un polymère ou une protéine standard, ce qui est apprécié par de nombreux utilisateurs. De plus, la masse moléculaire mesurée par le détecteur LS est indépendante du type et de la structure du polymère.  

 

  Pour cette raison, la masse moléculaire mesurée par GPC-LS est appelée la masse moléculaire absolue. En réalité, tous les détecteurs GPC-LS nécessitent une calibration, et la plupart des détecteurs LS actuels dérivent la masse moléculaire à travers une extrapolation ou une correction de données, ce qui signifie qu’elle n’est pas absolument exacte. 

 

  Cette note d’application explique la théorie liée à ce problème et discute si LALS (Low Angle Light Scattering) est la seule technique LS qui mesure effectivement l’angle de diffusion proportionnel à la masse moléculaire. 

Théorie de la diffusion de lumière 


  Il est nécessaire d’examiner la corrélation entre les capacités mesurées (l’intensité de la lumière diffusée) et le résultat souhaité (la masse moléculaire moyenne en poids). Ces deux facteurs sont reliés par l’équation bien connue de Rayleigh. 

  Ici, Rœ=0° représente l’intensité de la diffusion à 0°, Mw est la masse moléculaire moyenne, c est la concentration de la solution, K est la constante optique définie par dn/dc et A2 est le second coefficient du viriel. 

 


  Dans le cas de solutions à faible concentration (c’est-à-dire, les conditions typiques de GPC), la concentration est si basse que cet effet peut être ignoré. Ainsi, l’équation est simplifiée comme suit. 

 


  En utilisant l’équation simplifiée, la Mw peut être dérivée directement à partir de l’intensité de la lumière diffusée. Cependant, il est nécessaire de comprendre que cette équation traite de la lumière diffusée à un angle de 0° (par exemple, 0°).  

  Bien sûr, il est impossible de mesurer la lumière diffusée à 0° en raison du faisceau laser incident, donc la lumière diffusée doit être mesurée sous plusieurs angles différents (Figure 1). Cependant, ce processus devient complexe car la quantité de lumière diffusée change considérablement selon l’angle de diffusion et la taille de la molécule mesurée.  

  L’effet de dépendance angulaire ne peut être ignoré que pour des molécules très petites. Cependant, lorsqu’une molécule est plus grande que 12 nm, des problèmes surviennent en solution. (1) 

 


Selon cette théorie, il existe essentiellement trois solutions possibles. 

 


1. Diffusion de lumière multi-angle (MALS).
Mesurez la lumière diffusée sous plus de deux angles et extrapolez les données à 0°. 

 


2. Diffusion de lumière à 90°/viscosité (RALS/viscosité).
Mesurez la lumière diffusée à 90° et utilisez les données de viscosité pour corriger à 0°. 

 


3. Diffusion de lumière à basse angle (LALS).
Mesurez à un angle faible proche de 0° où l’effet d’angle peut être ignoré. Aucune correction n’est nécessaire dans ce cas.    

  Des centaines d’équipements utilisant MALS et RALS/viscosity sont largement utilisés dans le monde entier, mais aucun de ces produits ne mesure directement la masse moléculaire. 

 


  Cette approche multi-angle repose toujours sur l’extrapolation de données, et l’approche RALS nécessite un viscosimètre pour corriger les données pour des molécules de grande taille. 

 


  Historiquement, après la première calibration, la LALS a été considérée comme la seule méthode absolue, car elle n’exigeait ni estimation ni manipulation des données comme dans l’approche Multiangle. 

  Les détecteurs LALS commerciaux produits de la fin des années 1970 au milieu des années 1980 s’inspiraient du Chromatix KMX-6. Mais dans les années 1990, aucun détecteur LALS n’était produit.  

  Ce n’est qu’en 2001 qu’un nouveau détecteur LALS de Viscotek a été lancé, redonnant aux utilisateurs du GPC-LS l’opportunité de mesurer directement des masses moléculaires absolues. 

 

 

Pourquoi l’approche Multi-angle pose problème 

 


  Les appareils Multi-angle se basent sur le principe de mesurer la lumière diffusée à plus de deux angles et d’extrapoler les valeurs mesurées à 0°. Pourtant, de nombreux utilisateurs pensent que les valeurs mesurées sont des masses moléculaires absolues.  

  En réalité, tous les appareils MALS nécessitent une procédure de calibration, donc cela n’est pas vrai. De plus, la masse moléculaire n’est pas directement mesurée, mais est le résultat d’une extrapolation de données. 

 


  C’est la plus grande faiblesse de la méthode MALS. Il existe différents types de diagrammes de données ou de courbes d’extrapolation qui existent : lequel doit être appliqué à chaque échantillon ? Debye ? Zimm ? Berry ? Pour les petites molécules, un ajustement linéaire des données donne les résultats les plus précis et, à mesure que la taille des molécules augmente, le type d’ajustement nécessaire change considérablement (2).  

 

  Pour les molécules de plus de 45 nm, le graphique des données prend la forme de courbes et la masse moléculaire extrapolée dépend du type de courbe sélectionné. En d’autres termes, pour les échantillons avec une gamme de molécules de différentes tailles, le choix de l’ajustement affectera toujours les résultats. 

 


  Un autre problème lié à l’approche multi-angle est l’absence de données dans la région critique des angles faibles. Les détecteurs multi-angle sont conçus pour recueillir des données sous divers angles, ce qui empêche de recueillir des données précises à un angle faible réel.  

 

  En conséquence, obtenir une masse moléculaire précise devient plus difficile. La précision de l’extrapolation (adéquation de l’ajustement) dépend de la proximité du point de données le plus bas de l’angle avec 0 et de la qualité de ce signal. (3) 

 

 

Diffusion de lumière à faible angle (LALS)

 


 ;Approche LALS avancée mesure la lumière diffusée aussi près que possible de 0° (dans ce cas 7°) pour éviter tous les problèmes d’extrapolation et d’ajustement de données. 

La Figure 2 montre l’intérieur d’un détecteur, mettant en évidence le chemin optique du détecteur. Ce design efficace permet de distinguer efficacement le faisceau incident de la lumière diffusée (4). Ainsi, nous pouvons obtenir un excellent rapport signal sur bruit à 7°.  

La Figure 3 illustre la comparaison du rapport signal sur bruit entre LALS (7°) et RALS (90°) pour les polymères de faible et de haute masse moléculaire. 

Dans la Figure 3a, pour les échantillons PEO de faible masse moléculaire, les deux détecteurs fournissent le même résultat, peu importe l’angle de diffusion. Ce chromatogramme, comparant directement le signal à 90° (RALS) et celui de LALS, révèle que LALS offre un meilleur rapport signal sur bruit. 

La signification de l’application directe du LALS est la plus prononcée lorsqu’on analyse des molécules de grande taille comme les polysaccharides. Ces types de molécules présentent une forte dépendance angulaire en termes de diffusion, ce qui pose un problème sérieux pour les méthodes RALS et particulièrement pour les approches multi-angle. 

Mesurer directement la lumière diffusée à 7° élimine le besoin d’extrapolation ou d’ajustement de données, et permet d’obtenir des masses moléculaires précises. La Figure 4 montre les résultats d’une mesure utilisant la méthode LALS sur un échantillon d’acide hyaluronique (5). 
 

 

 

Conclusion 

 

Grâce à l’arrivée de détecteurs LALS de pointe, les laboratoires GPC/SEC peuvent désormais mesurer avec précision la masse moléculaire des échantillons. 

L’utilisation du LALS permet d’éviter les problèmes d’extrapolation des données ou d’ajustement des données. En outre, les nouveaux produits LALS sont compacts, faciles à manipuler, et s’intègrent aisément aux systèmes de détection multi-intégrés incluant un viscosimètre (6), ce qui facilite la détermination simultanée des masses moléculaires et des structures (7, 8). 

Cela bouleverse l’idée préexistante selon laquelle plus il y a d’angles, mieux c’est. En réalité, pour mesurer la lumière diffusée, plus on est proche, mieux c’est.