Mesure de la mobilité électrophorétique des protéines – Zetasizer Nano ZSP

Mesure de la mobilité électrophorétique des protéines avec le Zetasizer Nano ZSP 

 

 

Introduction  

 


   Le Zetasizer Nano est un produit leader sur le marché dans le domaine des techniques de diffusion dynamique de la lumière et de diffusion de la lumière électrophorétique pour la mesure de la taille hydrodynamique et de la mobilité électrophorétique.  

 

   La diffusion dynamique de la lumière (DLS) est une méthode largement utilisée pour l’analyse des caractéristiques des protéines et de leurs formulations, permettant non seulement la mesure de la taille des molécules, mais aussi l’évaluation de leur stabilité. 

 

   Récemment, l’utilisation des protéines comme thérapeutiques biologiques a considérablement augmenté, ce qui a suscité un grand intérêt scientifique et commercial pour la stabilité des protéines en solution. La reconnaissance des comportements de formulation et de stabilité est cruciale pour produire des produits sûrs et commercialisables, et la demande d’outils pour analyser ces caractéristiques augmente.  

 

   La mobilité des protéines mesurée à l’aide de l’électrophorèse de diffusion de la lumière (ELS) est l’un des indicateurs des comportements de formulation et de la stabilité visqueuse[1].
 

   La mesure expérimentale de la mobilité des protéines pose deux défis pratiques.  

 

(i) Traiter des solutions protéiques signifie généralement traiter des concentrations diluées. Le terme DLS implique qu’il gère de faibles niveaux de lumière diffusée proportionalisés à la petite taille des molécules. La plupart des équipements basés sur la diffusion de la lumière disponibles ont manqué de l’intensité requise pour les mesures nécessaires.  

 

(ii) Pour mesurer la mobilité des protéines, un champ électrique doit être appliqué à l’échantillon, ce qui est un traitement physique qui peut encourager l’agrégation et endommager les protéines[2]. En conséquence, le résultat de la mesure de la mobilité peut refléter l’agrégation plutôt que la protéine elle-même.  

 


Les conditions suivantes sont nécessaires pour une mesure précise et précise de la mobilité des protéines :
1. Un instrument avec suffisamment de sensibilité pour mesurer les faibles mobilités électrophorétiques et le faible taux de comptage associés à une solution protéique diluée
2. Techniques de mesure qui réduisent le risque d’agrégation
3. Une procédure de mesure intelligente et automatisée qui reconnaît et minimise l’agrégation  

   Le Zetasizer Nano ZSP (ZSP, voir image 1A) et le logiciel associé ont été spécialement développés pour répondre à ces exigences. Le capteur de diffusion de la lumière du ZSP permet l’analyse d’échantillons de faible concentration et de petite taille, comme le lysozyme à une concentration limite d’environ 1mg/mL. En outre, la technique de diffusion de la lumière par décalage de phase (PALS) utilisée dans le ZSP améliore les performances de mesure des échantillons à faible mobilité comme les protéines.   

 

   Les scientifiques de Malvern Instruments ont découvert qu’une grande partie des agrégations générées lors de la mesure électrophorétique se produisent au niveau des électrodes[3]. Grâce à la méthode brevetée de protection contre la diffusion (voir image 1B) inventée par Malvern Instruments, les échantillons de protéines peuvent être protégés en étant séparés des électrodes cellulaires[2, 4].  

 

   Cela signifie que l’on peut appliquer une tension plus longue à partir de l’équipement pour obtenir des données plus fiables[3]. La méthode de barrière de diffusion a été citée dans les normes ASTM récentes relatives à la mesure de la mobilité des matériaux biologiques de taille nanométrique [2]. 

 


   Le logiciel Zetasizer pour le Zetasizer Nano ZSP inclut également des protocoles spéciaux pour la mesure de la mobilité des protéines. En réduisant la tension et en contrôlant soigneusement la température dans la cellule, la méthode prévient l’agrégation des échantillons.  

 

   Avant et après la mesure de la mobilité, le système mesure également la taille avec le même équipement optique (voir image 2). Par conséquent, la distribution granulométrique mesurée représente directement la population où la mobilité est mesurée. Si la taille est mesurée en utilisant un équipement optique différent de celui utilisé pour mesurer la mobilité, l’intensité de la lumière diffusée peut varier et les agrégats formés ne peuvent peut-être pas être différenciés. Par conséquent, il est souhaitable de mesurer la taille en utilisant le même ensemble optique. En mesurant la taille avec le même équipement optique avant et après la mesure de la mobilité, le Zetasizer Nano ZSP identifie toute agrégation imprévue qui aurait pu se produire pendant le processus de mesure.  

 


   Enfin, mesurer correctement la mobilité électrophorétique des protéines permet de calculer la charge des protéines basée sur une relation connue entre la mobilité et la charge des protéines[5].  

 

   En utilisant la nouvelle option calculatrice du logiciel Zetasizer, le calcul est possible. Cette note d’application décrira la mesure de la mobilité des protéines à l’aide du ZSP. La sensibilité du ZSP, la méthode efficace de barrière de diffusion et le protocole de mesure approprié permettent d’obtenir les mesures les plus précises possibles.
 

Méthode
 

   L’albumine sérique humaine (HSA) a été préparée à l’aide de deux solutions tampon pour atteindre une concentration finale d’environ 2mg/mL. Les conditions des solutions tampons utilisées étaient les suivantes. 

 

 1) Une solution tampon à pH 7 où la protéine est initialement dissoute, 2) Une solution tampon acide citrique à pH 4,3. L’échantillon est filtré à travers un filtre de 0,02μm pour éliminer l’effet des agrégats avant de commencer la mesure.  

 

   En utilisant la méthode de barrière de diffusion, il est possible d’éviter l’agrégation de l’échantillon au contact des électrodes cellulaires. Une cellule capillaire pliable et jetable est remplie d’une quantité appropriée de solution tampon. En utilisant l’extrémité d’une pipette à gel, 20μL de HSA (2mg/ml) est chargé dans la partie de la cellule où la lumière passe. La taille et le potentiel zêta sont mesurés après avoir placé la cellule dans l’appareil.  

 

   La taille hydrodynamique et la mobilité de l’HSA sont mesurées respectivement par DLS et ELS à l’aide du Zetasizer Nano ZSP. La taille et la mobilité mesurées sont toutes deux évaluées au même angle de diffusion pour garantir que le potentiel zêta mesuré est celui des protéines et non celui des matériaux agrégés. 

 


Résultats 

 


    

   Les figures 3A et 3D montrent la distribution granulométrique de l’échantillon mesurée au début de l’expérience à pH 7 et pH 4,3 respectivement. Comme prévu, on a constaté qu’il n’y avait qu’un seul pic dans la distribution granulométrique. La taille à pH 7 est de 3,8 nm, en bon accord avec la taille rapportée pour l’HSA.  

 

   De manière intéressante, la taille à pH 4,3 est de 4,1 nm, légèrement supérieure à celle à pH 7. Ce phénomène ne peut pas être attribué avec certitude à un changement structurel ou à un début d’agrégation en utilisant uniquement cette technique. 

 

   Ensuite, la mesure de la mobilité de l’échantillon commence et les résultats sont calculés. Les figures 3B et 3E montrent le graphe de fréquence des mesures de mobilité. Examiner le graphe de fréquence est un bon moyen d’évaluer la qualité des mesures[6].  

 

   Les protéines diffusent très rapidement en raison de leur petite taille. Bien que les protéines soient électrophorétiques pendant le processus de mesure, la vitesse de diffusion n’est pas complètement surmontée par l’électrophorèse.  

 

   Le résultat est un pic large du déplacement en fréquence de la lumière diffusée en raison de la composante de diffusion substantielle. Étant donné que les agrégats sont plus grands, le graphe de fréquence pour les échantillons contenant des agrégats a une composante de diffusion beaucoup plus petite et donc un pic plus grand et plus net. Cela est expliqué plus en détail dans la note d’application MRK1651-02 et la référence[4]. Ici, le graphe de fréquence ayant un pic large et peu profond indique que la mesure a été principalement réalisée sur les protéines et non sur les agrégats.
 

   La mobilité électrophorétique mesurée pour l’HSA à pH 7 est de -0,88±0,2μmcm/Vs, et à pH 4,3, elle est de 0,44±0,2μmcm/Vs. Ces résultats indiquent que le point isoélectrique de l’échantillon est entre les deux valeurs de pH. 

 


   Une fois la mobilité électrophorétique mesurée, le nouveau calculateur du logiciel Zetasizer permet de calculer la charge globale de la protéine à partir de la taille hydrodynamique mesurée et de la mobilité électrophorétique. Comme le montre la figure 4, la charge calculée de l’HSA à pH 7 est d’environ -18, tandis que la charge calculée à pH 4,3 est d’environ +10. 

   Les figures 3C et 3F montrent la distribution granulométrique après la mesure de la mobilité. Les résultats suggèrent qu’une très petite quantité d’agrégats s’est formée pendant la mesure. Dans les deux cas, le pic principal de la distribution est dominant, représentant 99% de la lumière diffusée à pH 7 et 90% de l’échantillon à pH 4,3.

 

   Par conséquent, les résultats dérivés de cette mobilité sont fiables. L’échantillon à pH 4,3 a également montré une tendance à la formation d’agrégats en l’absence d’un champ électrique, ce qui est probablement dû à l’effet du faible pH. Cet effet est également responsable d’une faible agrégation pendant la mesure.

 


Discussion 

 


   Les résultats globaux fournissent une mesure de la mobilité qui est comparable aux valeurs déjà connues. De plus, la mobilité mesurée des protéines est clairement visible à des valeurs de pH plus basses, comme prévu. La reproductibilité et l’excellence des mesures renforcent leur confiance en leur précision. Ceci est confirmé par l’examen du graphe de fréquence large et du niveau minimal d’agrégation dans les mesures de DLS suivantes.
 

   La charge protéique calculée a été comparée aux études de Tanford[2]. Tanford a montré que l’HSA a une valence d’environ -16 à pH 7, en bon accord avec les résultats présentés ici. De plus, le pH 4,3 montre qu’elle a une valence d’environ +20.  

 

   Cela est plus certain que les données présentées ici. Bien qu’il existe plusieurs raisons possibles, y compris la source du tampon utilisé et de l’HSA utilisé dans l’expérience, la concordance globale des valeurs peut être clairement expliquée par référence à la littérature [6]. 

 


   En utilisant conjointement le Zetasizer Nano ZSP et le logiciel, ainsi que la méthode de barrière de diffusion, il est garanti que les mesures précises et fiables sont effectuées dans le processus de mesure réel. Cela est réalisé de trois manières distinctes. 

 


   1. La méthode de barrière de diffusion empêche l’agrégation des échantillons de protéines sur les électrodes.
   2. Le logiciel Zetasizer a automatisé à la fois l’optimisation et la mesure de la taille des protéines et du potentiel zêta, ce qui réduit l’entrée de l’utilisateur et améliore la précision des mesures.
   3. Le Zetasizer Nano ZSP garantit la précision des mesures à l’utilisateur en utilisant le même ensemble optique avec une sensibilité supérieure pour mesurer à la fois la taille et le potentiel zêta.  

 


   En conclusion, la mobilité de l’HSA a été mesurée avec succès à une concentration de 2mg/mL dans des tampons à pH7 et pH4.3. La méthode de barrière de diffusion permet d’effectuer ces mesures avec un coût minimal d’échantillon, car seule une petite quantité d’échantillon de protéine est nécessaire (dans ce cas 20μL). 

[1] Laue, Proteins in Serum – Colloids vs molecular views, presentation at Colorado Protein Stability Conference, 2011
[2] ASTM2865 – Standard guide for measurement of electrophoretic mobility and zeta potential of nanosized biological materials
[3] Corbett, Connah & Mattison, Electrophoresis. In press 2011
[4] Corbett, Connah & Mattison, Patent Pending
[5] Loeb, A.L, Wiersema, P.H. and Overbeek, (1961) « The Electrical Double Layer around a Spherical Colloid Particle » MIT Press, Cambridge Mass
[6] Corbett & Jack, Colloids & Surfaces A: Physiochemical and Engineering Aspects. (2010) 376 pp31-41