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Détermination du poids moléculaire des protéines: 

SEC-MALS comparé à la calibration conventionnelle

Les caractéristiques physiques et le comportement des protéines en solution varient en fonction de plusieurs facteurs, liés à la pureté et à la formulation de la protéine, ainsi qu’à ses propriétés intrinsèques.

La chromatographie d’exclusion de taille (SEC) est un outil puissant couramment utilisé pour examiner la récupération, le poids moléculaire et l’agrégation des protéines. 

Le principe du SEC repose sur la séparation de l’échantillon en le faisant circuler à travers une matrice de colonne perméable et inerte. Les petites molécules passent plus profondément à travers les pores, tandis que les plus grandes sont exclus, traversant donc la colonne plus rapidement. Le résultat est une séparation en fonction du volume hydrodynamique, bien que l’objectif final soit généralement de déterminer le poids moléculaire.

 Auparavant, le poids moléculaire était estimé en comparant le temps d’élution de la protéine inconnue avec celui de protéines standards de poids moléculaire connu, une méthode appelée ‘calibration conventionnelle’. Cette méthode était réalisée à l’aide de détecteurs de concentration uniques tels que les UV, etc.  

< Système Malvern Viscotek SEC-MALS 20 > 

Mais il est désormais possible de mesurer le poids moléculaire des protéines indépendamment du temps de rétention en utilisant à la fois un détecteur de diffusion de lumière et un détecteur de concentration (UV ou indice de réfraction, RI). Cette technique est très utile car la plupart des protéines n’ont pas une structure sphérique, rendant ainsi le poids moléculaire mesuré inexact. En ajoutant un deuxième détecteur de concentration, IV (viscosité intrinsèque), DLS (diffusion dynamique de la lumière), etc., la quantité d’information disponible à partir d’une seule mesure SEC augmente considérablement.

Le système Malvern Viscotek SEC-MALS 20 est un équipement de diffusion de lumière avec 20 angles de détection, capable de mesurer le poids moléculaire des protéines indépendamment du volume d’élution.  Cette note d’application fournira des informations sur la séparation de diverses protéines à l’aide du SEC. 

De plus, après avoir mesuré le poids moléculaire à l’aide de MALS (Multi Angle Light Scattering: diffusion de lumière multi-angle) ou de la calibration conventionnelle, les différences dans les résultats seront discutées.